Protocole G: RT-qPCR Flashcards
G0: Lyse chimique des cellules
Quel type de tampon on utilise
RLT
Ensuite on gratte le fond hihi
À quoi sert la technique de RT-PCR:
Synthétiser, amplifier et quantifier un ADN de séquence complémentaire (ADNc) à un ARN
Donne les 3 étapes RT-PCR:
1.Extraction ARN TOTAL de cellules animales
2.Réaction de transcription inverse: synthèse du premier brin ADNc à partir de l’ARNm avec la transcriptase onverse
- qPCR: Amplification spécifique d’un ADNc bicaténaire et quantification du nombre de copies produites par émission de fluorescence
Comment on quantifie?
lorsque les molécules fluorescentes se lient à l’ADN db (signal fluorescent est capté par l’appareil et est proportionnel à la qte de copies d’ADN db dans échantillion)
Dit les 6 étapes
- amorece 3’ se lie à l’ARNm
- Transcription inverse 3’–»5’ par la RT pour former un ADNc
- Débute le PCR: Dénaturation (95 degrés)
- Hybridation d’une amorce 5’ avec un fluorophore (60 degrés)
- Élongation avec la TAQ polymérase (72 degrés)
- 2e qPCR
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Définit les ARNribosomiques
-80% ARN cellulaire
-28S, 18S, 5, 8S et 5S
-S= coefficient de sédimentation
-Plus la valeur est élevée, plus rapide est le déplacement de la molécule soumise a une force centrifuge et plus la taille est grande
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Définit les ARN de transfert
-18% ARN total
-Homogène dans leur composition
-Peuvent être purifié selon leur poids ou leur densité
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Définit les ARNmessagers
-2% ARN total
-Poids et formes hétérogènes
-Chaine terminale polyadénylée–»peuvent être purifiés par affininté sur colonne de cellulose oligo-dT
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Dans quels mécansime ont les retrouves
synthèse protéique non-spécifique.
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Pk on s’intéresse au ARN messagers dans les études cellulaires?
Elles déterminent le niveau d’expression des protéines
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Une quantité ARN messager à un moment donné est…
équilibre entre la vitesse de dégradation et de synthèse
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Comment l’ARN se dégrade
Par des ribonucléases: enzymes qu’on retrouve partout
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Quel est l’étape après l’extraction de l’ARN et décrit là
Vérifier l’état de l’ARN sur un gel d’agarose NON DÉNATURANT
bandes 28S et 18S sont prédominantes si L’ARN EST INTACT
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Nomme des précautions pour éviter de contaminer le matériel et les solutions
Utiliser matériel STÉRILE ET À USAGE UNIQUE
Solution avec eau exempte de nucléases et produits seulement pour manipulation d’ARN
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Nomme des précautions pour éviter la contamination par le manipulateur
Source principale: RNases sur mains
-Gant jetables et les changer après la manip
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Nomme des précautions pour éviter la contamination par des RNases de sources internes
-SDS (détergent fort): pas efficace à 100%
-complexes vanadryl-ribonucléoside: inhibiteur de RNase mais doivent être séparé de l’ARN par extraction phénol-chloroforme
-Guanidine isothiocyanate: Combiné à un agent réducteur qui détruit activité RNasique! On utilise celui-ci!
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Quel est la propriété principale de RLT
lyse membrane cellulaire
contient guanidine isothiocyanate
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Lors de l’adsoption de l’ARN réversible sur colonne de silice, on centrifuge à quelle température
Pièce
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Lors du lavage d’ARN on ajoute quels tampons en ordre
- RW1
2.RPE
- RPE (centri 2 minutes pas 15 secondes!!)
- Rien et centri encore 1minutes
G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen
Lors de l’élution d’ARN, on prends un nouveau microtube et on rajoute quel liquide?
Eau exempte de nucléase et on centrifuge 1 minute
G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN
On utilise qu’elle longeur d’onde pour les purine et pyrimidine?
260 nm
G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN
ue détermine le ration 260/280
S’il y a une contamination de protéine. Pour avoir un bon ration: il faut autour de 1.8-2.0 (extra pur d’ARN)
G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN
On utilise qu’elle longeur Que détermine le ration 260/230
S’il y a présence de contamination chimiques (sels, guanidine) Il faut une ration entre 2.0-2.2 pour avoir des acide nucléiques purs
G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN
On utilise quel spectro
Nanodrop 2000
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Quel ARN vise-t-on
Régulation de l’expression de gêne particuliers= ARNm
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Comment on détermine l’intégrité de l’ARNm et pk?
En assumant la qualité et la quantité d’ARNr
3 à 7% ARN total donc utilise ARNr 28S et 18S se retroivant chez mammifères (80%-90%)
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Décrit les grandes lignes de préparation du gel d’agarose non dénaturant
- Préapre TAE 1X à partir de la 10X (on veut un gel à 1% d’agarose donc bien peser)
- Tranférer enrlenmeyer et ajoute TAE 1X
- Porter le mélange à ébullition –»micro-onde
4.Refroidissment à 45 degrés
- Assemble montage et mettre GelRed
- Laisser la polymérisation se faire de 20 à 30 minutes
- Placer le gel dans l’appareil à électrophorèse du coté de la cathode (-) et remplir le réservoir avec du TAE 1X FROID
- Retire peigne quand gel est recouvert de tampon
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Dans la préparation des échantillon, pk on fait chauffer à 65 degré l’ARN des cellules NIH-3T3
Pour détruire les strucures secondaires dans l’ARN
ensuite il est imp de centri à 4 degrés et recueillir l’ARn avec de l’eau exempte de nucléases
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Dans la préparation des échantillons, on recueille l’ARN chauffée et refroidie rapidement. Quel tampon de chargement ajoute-on après
LB-6X
G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant
Lors de la migration et détection, comment se fait elle? Quelle colorant on utilise pour la détection?
cathode à l’anode
On utilise le bleu de bromophénol et il doit être rendu au 2/3 du gel pour stopper le tout
G4: Réaction de la transcription inverse (RT)
Au début, Il faut pipetter un volume équivalent à combien de ug
1 ug
G4: Réaction de la transcription inverse (RT)
Ensuite, on chauffe à cb de degrés pour détruire les structures secondaire d’ARN
65 degrés pendant 5 minutes
Et on centrifuge après à 4 degrés (comme dans G3)
Cependant on conserve l’ARN sur glace
G4: Réaction de la transcription inverse (RT)
Après avoir fait le mélange réactionnel, il est important de bien mélanger. On incube les échantillons comment
60 minutes à 42
centri à 4
G4: Réaction de la transcription inverse (RT)
Après l’incubation de 60 minute à 42 degrés, on doit chuffer comment les échantillons
à 95 pour inactiver la transcriptase inverse et dissocier les complexe ADNc-ARN
entrpose à -20 ensuite
G5: Réaction de qPCR
Dans la préparation des mélanges réactionnels, on prépare 12 tubes A à L. Ensuite que contient le mélange réactionnel de c-fos (A à F)
Amorce 5’ sens
AMorce 3’ antisens
SYBR Green
G5: Réaction de qPCR
Dans la préparation des mélanges réactionnels, on amplifie aussi une autre molécule. Laquelle et que contient sont mélange réactionnel (G à L)
Bêta-microglobuline (sert de contrôle endogène)
Amorce 5’ sens
Amorce 3’ antisens
SYBR Green
G5: Réaction de qPCR
Quelle est l’étape après la préparation des échantillons
Préparation de l’ADNc complémentaire effectué à G4 par la RT
(on dilue ADNc avec l’eau exempte de nucléases)
G5: Réaction de qPCR
Quelle est l’étape après la préparation de l’ADNc
Préparation de la réaction qPCR
-mélange en évittant de faire des bulles et on met les microtubes dans l,appareil à qPCR:
- Dénaturation initiale 95 degrés, 1min
- Dénaturation 95 degrés, 10 sec
3.Hybridation 58 degrés, 10 sec
4.Élongation 72 degrés, 15 sec - Courbe de fusion
G5: Réaction de qPCR
Cb de cycle faisons nous
33
G6: Analyse des résultats de qPCR
C’est quoi le Tm et que représente-elle
Température de fusion
température à laquelle la moitié d’une séquence deviens sb
G6: Analyse des résultats de qPCR
Quel sont les 2 paramètres liés au Tm importants
-ADN se dénature avec une augmentation de température. Si l’ADN se dénature, le SYBR green arrête d’émettre sa fluoresncence puisque il en émet quand il est lié à de l’ADN intact. L,appareil détecte la diminution de la fluoresnce
G6: Analyse des résultats de qPCR
Le Tm représente quoi sur la courbe température de fusion
Le point d’inflexion
G6: Analyse des résultats de qPCR
Si on fait la dérivée de la courbe de température de fusion, que retrouve-on
Vérifie la spécificité de l’amplification. Si il y a un pic (point d’inflexion) cela veut dire qu’un seul produit a été amplifié
G6: Analyse des résultats de qPCR
Aussi, la Tm peut être utilisé pour comparer quoi?
la nature des séquences
G6: Analyse des résultats de qPCR
C’est quoi la donnée Cq
données expérimentale pour quantifier et comparer les échantillons.
Point d’intersection entre la courbe d’amplification et le seuil de détection
G6: Analyse des résultats de qPCR
Que détermine la fluorescence dans les données Cq
Fluo est proportionnelle au nb de copies d’ADN amplifié.
Un ADNc en grande qte aura besoin de peu d’amplification pour atteindre le seuil= Cq bas
G6: Analyse des résultats de qPCR
Comment peut-on comparer notre Cq obtenu
Avec les données d’expression d’un deuxième gène (gène controle) car l’expression est stable et ne varie pas sous l’effet du traitment
G6: Analyse des résultats de qPCR
Pour bien avoir le % d’expression relative il faut 2 choses
-Un contrôle endogène: Gène qui ne varie pas suite au traitmeent effectué
-Un calibrateur: Échantillon auquel seront comparés les autres échantillons. Il n’a pas subit de traitement, mais il est manipulé de la même manière.
