1. amorece 3' se lie à l'ARNm 2. Transcription inverse 3'--»5' par la RT pour former un ADNc 3. Débute le PCR: Dénaturation (95 degrés) 4. Hybridation d'une amorce 5' avec un fluorophore (60 degrés) 5. Élongation avec la TAQ polymérase (72 degrés) 6. 2e qPCR

Protocole G: RT-qPCR Flashcards by Maxandre Pichereau

G0: Lyse chimique des cellules

Quel type de tampon on utilise

RLT

Ensuite on gratte le fond hihi

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À quoi sert la technique de RT-PCR:

Synthétiser, amplifier et quantifier un ADN de séquence complémentaire (ADNc) à un ARN

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Donne les 3 étapes RT-PCR:

1.Extraction ARN TOTAL de cellules animales

2.Réaction de transcription inverse: synthèse du premier brin ADNc à partir de l’ARNm avec la transcriptase onverse

qPCR: Amplification spécifique d’un ADNc bicaténaire et quantification du nombre de copies produites par émission de fluorescence

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Comment on quantifie?

lorsque les molécules fluorescentes se lient à l’ADN db (signal fluorescent est capté par l’appareil et est proportionnel à la qte de copies d’ADN db dans échantillion)

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Dit les 6 étapes

amorece 3’ se lie à l’ARNm
Transcription inverse 3’–»5’ par la RT pour former un ADNc
Débute le PCR: Dénaturation (95 degrés)
Hybridation d’une amorce 5’ avec un fluorophore (60 degrés)
Élongation avec la TAQ polymérase (72 degrés)
2e qPCR

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARNribosomiques

-80% ARN cellulaire
-28S, 18S, 5, 8S et 5S
-S= coefficient de sédimentation
-Plus la valeur est élevée, plus rapide est le déplacement de la molécule soumise a une force centrifuge et plus la taille est grande

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARN de transfert

-18% ARN total
-Homogène dans leur composition
-Peuvent être purifié selon leur poids ou leur densité

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARNmessagers

-2% ARN total
-Poids et formes hétérogènes
-Chaine terminale polyadénylée–»peuvent être purifiés par affininté sur colonne de cellulose oligo-dT

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Dans quels mécansime ont les retrouves

synthèse protéique non-spécifique.

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Pk on s’intéresse au ARN messagers dans les études cellulaires?

Elles déterminent le niveau d’expression des protéines

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Une quantité ARN messager à un moment donné est…

équilibre entre la vitesse de dégradation et de synthèse

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Comment l’ARN se dégrade

Par des ribonucléases: enzymes qu’on retrouve partout

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Quel est l’étape après l’extraction de l’ARN et décrit là

Vérifier l’état de l’ARN sur un gel d’agarose NON DÉNATURANT

bandes 28S et 18S sont prédominantes si L’ARN EST INTACT

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter de contaminer le matériel et les solutions

Utiliser matériel STÉRILE ET À USAGE UNIQUE

Solution avec eau exempte de nucléases et produits seulement pour manipulation d’ARN

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter la contamination par le manipulateur

Source principale: RNases sur mains

-Gant jetables et les changer après la manip

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter la contamination par des RNases de sources internes

-SDS (détergent fort): pas efficace à 100%

-complexes vanadryl-ribonucléoside: inhibiteur de RNase mais doivent être séparé de l’ARN par extraction phénol-chloroforme

-Guanidine isothiocyanate: Combiné à un agent réducteur qui détruit activité RNasique! On utilise celui-ci!

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Quel est la propriété principale de RLT

lyse membrane cellulaire

contient guanidine isothiocyanate

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors de l’adsoption de l’ARN réversible sur colonne de silice, on centrifuge à quelle température

Pièce

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors du lavage d’ARN on ajoute quels tampons en ordre

2.RPE

RPE (centri 2 minutes pas 15 secondes!!)
Rien et centri encore 1minutes

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G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors de l’élution d’ARN, on prends un nouveau microtube et on rajoute quel liquide?

Eau exempte de nucléase et on centrifuge 1 minute

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise qu’elle longeur d’onde pour les purine et pyrimidine?

260 nm

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

ue détermine le ration 260/280

S’il y a une contamination de protéine. Pour avoir un bon ration: il faut autour de 1.8-2.0 (extra pur d’ARN)

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise qu’elle longeur Que détermine le ration 260/230

S’il y a présence de contamination chimiques (sels, guanidine) Il faut une ration entre 2.0-2.2 pour avoir des acide nucléiques purs

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise quel spectro

Nanodrop 2000

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Quel ARN vise-t-on

Régulation de l'expression de gêne particuliers= ARNm

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Comment on détermine l'intégrité de l'ARNm et pk?

En assumant la qualité et la quantité d'ARNr 3 à 7% ARN total donc utilise ARNr 28S et 18S se retroivant chez mammifères (80%-90%)

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Décrit les grandes lignes de préparation du gel d'agarose non dénaturant

1. Préapre TAE 1X à partir de la 10X (on veut un gel à 1% d'agarose donc bien peser) 2. Tranférer enrlenmeyer et ajoute TAE 1X 3. Porter le mélange à ébullition --»micro-onde 4.Refroidissment à 45 degrés 5. Assemble montage et mettre GelRed 6. Laisser la polymérisation se faire de 20 à 30 minutes 7. Placer le gel dans l'appareil à électrophorèse du coté de la cathode (-) et remplir le réservoir avec du TAE 1X FROID 8. Retire peigne quand gel est recouvert de tampon

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Dans la préparation des échantillon, pk on fait chauffer à 65 degré l'ARN des cellules NIH-3T3

Pour détruire les strucures secondaires dans l'ARN ensuite il est imp de centri à 4 degrés et recueillir l'ARn avec de l'eau exempte de nucléases

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Dans la préparation des échantillons, on recueille l'ARN chauffée et refroidie rapidement. Quel tampon de chargement ajoute-on après

LB-6X

G3: Vérification de l'intégrité de l'ARN sur gel d'agarose non-dénaturant Lors de la migration et détection, comment se fait elle? Quelle colorant on utilise pour la détection?

cathode à l'anode On utilise le bleu de bromophénol et il doit être rendu au 2/3 du gel pour stopper le tout

G4: Réaction de la transcription inverse (RT) Au début, Il faut pipetter un volume équivalent à combien de ug

1 ug

G4: Réaction de la transcription inverse (RT) Ensuite, on chauffe à cb de degrés pour détruire les structures secondaire d'ARN

65 degrés pendant 5 minutes Et on centrifuge après à 4 degrés (comme dans G3) Cependant on conserve l'ARN sur glace

G4: Réaction de la transcription inverse (RT) Après avoir fait le mélange réactionnel, il est important de bien mélanger. On incube les échantillons comment

60 minutes à 42 centri à 4

G4: Réaction de la transcription inverse (RT) Après l'incubation de 60 minute à 42 degrés, on doit chuffer comment les échantillons

à 95 pour inactiver la transcriptase inverse et dissocier les complexe ADNc-ARN entrpose à -20 ensuite

G5: Réaction de qPCR Dans la préparation des mélanges réactionnels, on prépare 12 tubes A à L. Ensuite que contient le mélange réactionnel de c-fos (A à F)

Amorce 5' sens AMorce 3' antisens SYBR Green

G5: Réaction de qPCR Dans la préparation des mélanges réactionnels, on amplifie aussi une autre molécule. Laquelle et que contient sont mélange réactionnel (G à L)

Bêta-microglobuline (sert de contrôle endogène) Amorce 5' sens Amorce 3' antisens SYBR Green

G5: Réaction de qPCR Quelle est l'étape après la préparation des échantillons

Préparation de l'ADNc complémentaire effectué à G4 par la RT (on dilue ADNc avec l'eau exempte de nucléases)

G5: Réaction de qPCR Quelle est l'étape après la préparation de l'ADNc

Préparation de la réaction qPCR -mélange en évittant de faire des bulles et on met les microtubes dans l,appareil à qPCR: 1. Dénaturation initiale 95 degrés, 1min 2. Dénaturation 95 degrés, 10 sec 3.Hybridation 58 degrés, 10 sec 4.Élongation 72 degrés, 15 sec 5. Courbe de fusion

G5: Réaction de qPCR Cb de cycle faisons nous

G6: Analyse des résultats de qPCR C'est quoi le Tm et que représente-elle

Température de fusion température à laquelle la moitié d'une séquence deviens sb

G6: Analyse des résultats de qPCR Quel sont les 2 paramètres liés au Tm importants

-ADN se dénature avec une augmentation de température. Si l'ADN se dénature, le SYBR green arrête d'émettre sa fluoresncence puisque il en émet quand il est lié à de l'ADN intact. L,appareil détecte la diminution de la fluoresnce

G6: Analyse des résultats de qPCR Le Tm représente quoi sur la courbe température de fusion

Le point d'inflexion

G6: Analyse des résultats de qPCR Si on fait la dérivée de la courbe de température de fusion, que retrouve-on

Vérifie la spécificité de l'amplification. Si il y a un pic (point d'inflexion) cela veut dire qu'un seul produit a été amplifié

G6: Analyse des résultats de qPCR Aussi, la Tm peut être utilisé pour comparer quoi?

la nature des séquences

G6: Analyse des résultats de qPCR C'est quoi la donnée Cq

données expérimentale pour quantifier et comparer les échantillons. Point d'intersection entre la courbe d'amplification et le seuil de détection

G6: Analyse des résultats de qPCR Que détermine la fluorescence dans les données Cq

Fluo est proportionnelle au nb de copies d'ADN amplifié. Un ADNc en grande qte aura besoin de peu d'amplification pour atteindre le seuil= Cq bas

G6: Analyse des résultats de qPCR Comment peut-on comparer notre Cq obtenu

Avec les données d'expression d'un deuxième gène (gène controle) car l'expression est stable et ne varie pas sous l'effet du traitment

G6: Analyse des résultats de qPCR Pour bien avoir le % d'expression relative il faut 2 choses

-Un contrôle endogène: Gène qui ne varie pas suite au traitmeent effectué -Un calibrateur: Échantillon auquel seront comparés les autres échantillons. Il n'a pas subit de traitement, mais il est manipulé de la même manière.