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Lab BCL 509 > Protocole G: RT-qPCR > Flashcards

Protocole G: RT-qPCR Flashcards

1
Q

G0: Lyse chimique des cellules

Quel type de tampon on utilise

A

RLT

Ensuite on gratte le fond hihi

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Q

À quoi sert la technique de RT-PCR:

A

Synthétiser, amplifier et quantifier un ADN de séquence complémentaire (ADNc) à un ARN

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3
Q

Donne les 3 étapes RT-PCR:

A

1.Extraction ARN TOTAL de cellules animales

2.Réaction de transcription inverse: synthèse du premier brin ADNc à partir de l’ARNm avec la transcriptase onverse

  1. qPCR: Amplification spécifique d’un ADNc bicaténaire et quantification du nombre de copies produites par émission de fluorescence
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Q

Comment on quantifie?

A

lorsque les molécules fluorescentes se lient à l’ADN db (signal fluorescent est capté par l’appareil et est proportionnel à la qte de copies d’ADN db dans échantillion)

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5
Q

Dit les 6 étapes

A
  1. amorece 3’ se lie à l’ARNm
  2. Transcription inverse 3’–»5’ par la RT pour former un ADNc
  3. Débute le PCR: Dénaturation (95 degrés)
  4. Hybridation d’une amorce 5’ avec un fluorophore (60 degrés)
  5. Élongation avec la TAQ polymérase (72 degrés)
  6. 2e qPCR
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6
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARNribosomiques

A

-80% ARN cellulaire
-28S, 18S, 5, 8S et 5S
-S= coefficient de sédimentation
-Plus la valeur est élevée, plus rapide est le déplacement de la molécule soumise a une force centrifuge et plus la taille est grande

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7
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARN de transfert

A

-18% ARN total
-Homogène dans leur composition
-Peuvent être purifié selon leur poids ou leur densité

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8
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Définit les ARNmessagers

A

-2% ARN total
-Poids et formes hétérogènes
-Chaine terminale polyadénylée–»peuvent être purifiés par affininté sur colonne de cellulose oligo-dT

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9
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Dans quels mécansime ont les retrouves

A

synthèse protéique non-spécifique.

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10
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Pk on s’intéresse au ARN messagers dans les études cellulaires?

A

Elles déterminent le niveau d’expression des protéines

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11
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Une quantité ARN messager à un moment donné est…

A

équilibre entre la vitesse de dégradation et de synthèse

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12
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Comment l’ARN se dégrade

A

Par des ribonucléases: enzymes qu’on retrouve partout

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13
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Quel est l’étape après l’extraction de l’ARN et décrit là

A

Vérifier l’état de l’ARN sur un gel d’agarose NON DÉNATURANT

bandes 28S et 18S sont prédominantes si L’ARN EST INTACT

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14
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter de contaminer le matériel et les solutions

A

Utiliser matériel STÉRILE ET À USAGE UNIQUE

Solution avec eau exempte de nucléases et produits seulement pour manipulation d’ARN

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15
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter la contamination par le manipulateur

A

Source principale: RNases sur mains

-Gant jetables et les changer après la manip

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16
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Nomme des précautions pour éviter la contamination par des RNases de sources internes

A

-SDS (détergent fort): pas efficace à 100%

-complexes vanadryl-ribonucléoside: inhibiteur de RNase mais doivent être séparé de l’ARN par extraction phénol-chloroforme

-Guanidine isothiocyanate: Combiné à un agent réducteur qui détruit activité RNasique! On utilise celui-ci!

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17
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Quel est la propriété principale de RLT

A

lyse membrane cellulaire

contient guanidine isothiocyanate

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18
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors de l’adsoption de l’ARN réversible sur colonne de silice, on centrifuge à quelle température

A

Pièce

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19
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors du lavage d’ARN on ajoute quels tampons en ordre

A
  1. RW1

2.RPE

  1. RPE (centri 2 minutes pas 15 secondes!!)
  2. Rien et centri encore 1minutes
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20
Q

G1: Extraction d’ARN total des cellules NIH 3T3 avec trousse RNeasy de Qiagen

Lors de l’élution d’ARN, on prends un nouveau microtube et on rajoute quel liquide?

A

Eau exempte de nucléase et on centrifuge 1 minute

21
Q

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise qu’elle longeur d’onde pour les purine et pyrimidine?

A

260 nm

22
Q

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

ue détermine le ration 260/280

A

S’il y a une contamination de protéine. Pour avoir un bon ration: il faut autour de 1.8-2.0 (extra pur d’ARN)

23
Q

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise qu’elle longeur Que détermine le ration 260/230

A

S’il y a présence de contamination chimiques (sels, guanidine) Il faut une ration entre 2.0-2.2 pour avoir des acide nucléiques purs

24
Q

G2: Quantification au spectrophotomètre échantillon d’ARN

On utilise quel spectro

A

Nanodrop 2000

25
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Quel ARN vise-t-on

A

Régulation de l’expression de gêne particuliers= ARNm

26
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Comment on détermine l’intégrité de l’ARNm et pk?

A

En assumant la qualité et la quantité d’ARNr

3 à 7% ARN total donc utilise ARNr 28S et 18S se retroivant chez mammifères (80%-90%)

27
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Décrit les grandes lignes de préparation du gel d’agarose non dénaturant

A
  1. Préapre TAE 1X à partir de la 10X (on veut un gel à 1% d’agarose donc bien peser)
  2. Tranférer enrlenmeyer et ajoute TAE 1X
  3. Porter le mélange à ébullition –»micro-onde

4.Refroidissment à 45 degrés

  1. Assemble montage et mettre GelRed
  2. Laisser la polymérisation se faire de 20 à 30 minutes
  3. Placer le gel dans l’appareil à électrophorèse du coté de la cathode (-) et remplir le réservoir avec du TAE 1X FROID
  4. Retire peigne quand gel est recouvert de tampon
28
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Dans la préparation des échantillon, pk on fait chauffer à 65 degré l’ARN des cellules NIH-3T3

A

Pour détruire les strucures secondaires dans l’ARN

ensuite il est imp de centri à 4 degrés et recueillir l’ARn avec de l’eau exempte de nucléases

29
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Dans la préparation des échantillons, on recueille l’ARN chauffée et refroidie rapidement. Quel tampon de chargement ajoute-on après

A

LB-6X

30
Q

G3: Vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose non-dénaturant

Lors de la migration et détection, comment se fait elle? Quelle colorant on utilise pour la détection?

A

cathode à l’anode

On utilise le bleu de bromophénol et il doit être rendu au 2/3 du gel pour stopper le tout

31
Q

G4: Réaction de la transcription inverse (RT)

Au début, Il faut pipetter un volume équivalent à combien de ug

A

1 ug

32
Q

G4: Réaction de la transcription inverse (RT)

Ensuite, on chauffe à cb de degrés pour détruire les structures secondaire d’ARN

A

65 degrés pendant 5 minutes

Et on centrifuge après à 4 degrés (comme dans G3)

Cependant on conserve l’ARN sur glace

33
Q

G4: Réaction de la transcription inverse (RT)

Après avoir fait le mélange réactionnel, il est important de bien mélanger. On incube les échantillons comment

A

60 minutes à 42

centri à 4

34
Q

G4: Réaction de la transcription inverse (RT)

Après l’incubation de 60 minute à 42 degrés, on doit chuffer comment les échantillons

A

à 95 pour inactiver la transcriptase inverse et dissocier les complexe ADNc-ARN

entrpose à -20 ensuite

35
Q

G5: Réaction de qPCR

Dans la préparation des mélanges réactionnels, on prépare 12 tubes A à L. Ensuite que contient le mélange réactionnel de c-fos (A à F)

A

Amorce 5’ sens
AMorce 3’ antisens
SYBR Green

36
Q

G5: Réaction de qPCR

Dans la préparation des mélanges réactionnels, on amplifie aussi une autre molécule. Laquelle et que contient sont mélange réactionnel (G à L)

A

Bêta-microglobuline (sert de contrôle endogène)

Amorce 5’ sens
Amorce 3’ antisens
SYBR Green

37
Q

G5: Réaction de qPCR

Quelle est l’étape après la préparation des échantillons

A

Préparation de l’ADNc complémentaire effectué à G4 par la RT

(on dilue ADNc avec l’eau exempte de nucléases)

38
Q

G5: Réaction de qPCR

Quelle est l’étape après la préparation de l’ADNc

A

Préparation de la réaction qPCR

-mélange en évittant de faire des bulles et on met les microtubes dans l,appareil à qPCR:

  1. Dénaturation initiale 95 degrés, 1min
  2. Dénaturation 95 degrés, 10 sec
    3.Hybridation 58 degrés, 10 sec
    4.Élongation 72 degrés, 15 sec
  3. Courbe de fusion
39
Q

G5: Réaction de qPCR

Cb de cycle faisons nous

A

33

40
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

C’est quoi le Tm et que représente-elle

A

Température de fusion

température à laquelle la moitié d’une séquence deviens sb

41
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Quel sont les 2 paramètres liés au Tm importants

A

-ADN se dénature avec une augmentation de température. Si l’ADN se dénature, le SYBR green arrête d’émettre sa fluoresncence puisque il en émet quand il est lié à de l’ADN intact. L,appareil détecte la diminution de la fluoresnce

42
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Le Tm représente quoi sur la courbe température de fusion

A

Le point d’inflexion

43
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Si on fait la dérivée de la courbe de température de fusion, que retrouve-on

A

Vérifie la spécificité de l’amplification. Si il y a un pic (point d’inflexion) cela veut dire qu’un seul produit a été amplifié

44
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Aussi, la Tm peut être utilisé pour comparer quoi?

A

la nature des séquences

45
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

C’est quoi la donnée Cq

A

données expérimentale pour quantifier et comparer les échantillons.

Point d’intersection entre la courbe d’amplification et le seuil de détection

46
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Que détermine la fluorescence dans les données Cq

A

Fluo est proportionnelle au nb de copies d’ADN amplifié.

Un ADNc en grande qte aura besoin de peu d’amplification pour atteindre le seuil= Cq bas

47
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Comment peut-on comparer notre Cq obtenu

A

Avec les données d’expression d’un deuxième gène (gène controle) car l’expression est stable et ne varie pas sous l’effet du traitment

48
Q

G6: Analyse des résultats de qPCR

Pour bien avoir le % d’expression relative il faut 2 choses

A

-Un contrôle endogène: Gène qui ne varie pas suite au traitmeent effectué

-Un calibrateur: Échantillon auquel seront comparés les autres échantillons. Il n’a pas subit de traitement, mais il est manipulé de la même manière.

Lab BCL 509 (9 decks)

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