Protocole H: Immunobuvardage

Question 1

Ho: Obtention de culots de cellules

Quel type de tampon on met et on aspire directement après

Answer 1

Le PBS

on en remet après l’aspiration (1ml)

Question 2

Ho: Obtention de culots de cellules

Après la mise de PBS que faut-il faire

Answer 2

Gratter les cellules et enlever le PBS

Centrifuger à 4 degrés et enlever le surnageant

Conserver à -20

Question 3

Quelles sont les 4 étapes d’immunobuvardage

Answer 3

1. Migration des protéines sur SDS-PAGE
   2.Transfert des protéines séparées sur membrane de nitrocellulose
   3.L’incubation de la membrane avec anticorps primaire
2. Détecte à l’aide d’un anticorps secondaire et chimiluminescence

Question 4

Le choix d’acrylamide dépends de

Answer 4

du poids moléculaire des protéines à séparer

c-fos: 62 kDa
TBP: 35 KDA

Question 5

Quels sont les 2 réactifs pour la polymérisation dans le gel de concentration et de séparation

Answer 5

APS 10% et TEMED
*On les ajoute après avoir mélangé les autres composants

Question 6

Quelle est l’étape avant de faire polymériser

Answer 6

Ajout d’isopropanol

Question 7

On laisse polymriser cb de temps

Answer 7

30 min

Question 8

Quel tampon on utilise pour des gels SDS-PAGE pour l’é;ectrophorèse

Answer 8

Tampon d’électrophorèse 1X à partir de la 5X

(tampon de migration)

Question 9

Dans quel tampon va-t-on suspendre les culot des cellules

Answer 9

tampon 1X-SDS

Question 10

Quel marquer de poids utilise-t-on

Answer 10

marqueur de poids page ruler

Question 11

Lorsqu’on fait la migration, on arrête quand?

Answer 11

lorsque les protéines d’intérêt soit séparés et que la totalité du gel ait été utilisé (pas 2/3)

Question 12

H2: Transfert sur membrane nitrocellulose

On utilise quelle appareil

Answer 12

Trans-Blot Transfer System

Question 13

H2: Transfert sur membrane nitrocellulose

Décrit les grandes lignes

Answer 13

1. Humidifier par capillarité la membrane nitrocellulose avec eau nanopure
2. transfert membrane dans un deuxième contenant avec un peu de tampon de transfert froid
3. Humidifier 2 piles de 6 épaisseurs de papier de tissus de transfert dans un 3e bac avec tampon de transfert froid (1cm donc +)
4. Transfert avec le montage

Question 14

H2: Transfert sur membrane nitrocellulose

Comment se fait la migration

Answer 14

cathode (-) vers anode

Question 15

H3: Incubation des anticorps

Dans quel tampon met on la membrane au début

et décrit le déroulement

Answer 15

1.solution de blocage agitation pendant 1h

2.Placer les membranes dans pochette et ajouter anticorps primaire de lapin
-anti-c fos et anti-TBP

3. Incuber membranes à 4 degrés
4. Déposer les membrane dans TBST et agiter à T piece pendant 5 min
5. Ajout anticorps secondaire: anti-lapin-HRP
6. Agiter
7. Enlever les membrane etc.

Question 16

H4: Détection par chimiluminescence

Explique le principe

Answer 16

L’HRP lié à l’anticops secondaire avec du H2O2 peut oxydé le luminol (le substrat). Cela émet de la lumière en le rendant dans un état excité et reviens a son état fondamental

Question 17

H4: Détection par chimiluminescence

On utilise quel appareil?

Answer 17

Bio-Rad + solution de détection