Protocole F: Essais luciférase

Question 1

Qu’est ce que la luciférase

Answer 1

enzyme retrouvée chez les bioluminescent

Plus exploité: mouche à feu

Question 2

Luciférase est un gène….

Answer 2

Rapporteur: étudie la régulation de l’expression génique

Question 3

Décrit la réaction chimique de la luciférase

Answer 3

1.Décarboxylation oxydative de la D-luciférine

D-luciférine+ATP-Mg2+——»luciféryl-AM+ PPi

2.Génération oxy-luciférine

luciféryl-AMP + O2—»oxy-luciférine +CO2+AMP+hv(560)nm

Question 4

Longueur d’onde luciférase

Answer 4

560 nm

Question 5

Pourquoi on utilise la luciférase comme gêne rapporteur?

Answer 5

-mesurer activité transcription de certains promoteurs

-identifier prot qui influence transcription de gène

-taux de renouvellement d’une protéines intracell

Question 6

Explique ce qu’est un essai luciférase

Answer 6

Incube le lysat en excès de substrat (D-luciférine et ATP) et mesurer la luminescence qui est proportionelle à la qte de l’enzyme (oxy-luciférase) synthétisé dans la cellules

Question 7

Avec quelle appareil peut on évaluer la luminescence

Answer 7

Luminomètre

Question 8

Donne les 3 facteurs de variation affectant la crédibilité des résultats obtenus

Answer 8

nb de cell encemencées

efficacité transfection

mort cell durant l’expérience

Question 9

COmment assurer la validité

Answer 9

Duplicata/triplicata pour les échantillons

Co-transfection des cellules avec gène rapporteur (dont expression est constitutif) style pRL-TK

Question 10

Quels sont les 2 tampons utilisés

Answer 10

LAR II et Stop and Glo

Question 11

unité de mesure de l’appareil

Answer 11

RLU

Question 12

Décrit comment nous allons faire la lecture

Answer 12

1. Lecture luciférase mouche à cheveux (560nm)

2.Ajout Stop and Go

3. Lecture de luciférase de rénilla (480 nm)

Question 13

longeur d’onde luciférase de RÉnilla

Answer 13

480 nm