Projet 3 théorie partie 2 bactérie time!

Question 1

3.5 Transformation bactérienne de l’assemblage de Gibson

Généralités

Answer 1

-Introduction dans bact= La transformation pour que bact produise bcp plasmide
-Production de bcp plasmide grâce à origine de répli

-Les bacts sont étalés sur gélose avec antibiotique (seule les bact qui on gène de résistance grâce à l’acquisition d’un plasmide vont pousser)

-Extraction et Purification plasmides à partir de cultures de diff clones bactériens

-Étape à venir après transfo: 1.Extractions plasmidiques via digestion avec enzyme de restriction et séquençage pour confirmer ou non l’obtention de l’assemblage désiré (si on a réussi)

Question 2

3.5 Transformation bactérienne de l’assemblage de Gibson

Transformation (l’expliquer)

Answer 2

-il faut des bacts compétente à recevoir un plasmide
-mettre cellule + ADN plasmidique (voir 3.6) dans solution CaCl2 et induire un choc thermique à 42 degrés
-Les ions Ca2+ vont protéger charges négatives de ADN (rendre plasmides moins polaires)
-Choc thermique crée des pores dans membrane bactérienne pour faire entrer plasmides

Question 3

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Plasmides:

Answer 3

-ADN extra chromosomique qui se réplique de façon autonome
-Naturellement dans bact et encondent pour prots importantes (ex: résistance aux antibio)
-ADN double brin, circulaire et petite taille (10kpb ou moins)
-10 à 700 copies par bact
-Ils sont utilisés comme vecteurs d’ADN (mol qui permette transfert de propriétés dans cell hote)
-Ce sont des plasmides recombinants
-Pour détecter les plasmides qui contiennent l’ADN qu’on veut: CLONAGE (produire qte grande du fragment d’ADN qu’on introduit dans vect plasmidique, car l’ADN plasmidique est facile à purifier

Question 4

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Composition constante d’un plasmide:

Answer 4

-Origine de répli d’un site de clonage multiple (plasmides introduits se réplique dans la bact)
-Gène de sélection à un transformant (gène résistance à antibiotique pour se développer sur un milieu avec le même antibio)
-Bref ADN plasmidique est produit par bact en culture!

Question 5

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Généralités (après la culture bactérienne):

Answer 5

-un plasmide peut atteindre nombre élevé de copies suite à la transformation
-on l’extrait et on le purifie ensuite de la culture (Essentiellement c’est de lyser les bacts et séparer ADN plasmidique de l’ADN génomique et des autres composantes cellulaires)

Question 6

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Méthode d’extraction et purification: La lyse alcaline de Birhboim et Doly

Answer 6

-Couplé avec du SDS pour purifier ADN plasmidique de E.Coli
-Le détergent anionique à pH élevé=lyse paroi cell+dénature le chromosome bactérien+dénature prot+ADN plasmidique devient le surnageant
-pH élevé précisément dénature toutes les mol d’ADN—»ils deviennent entremêlés
*Si pH reviens neutre—» renaturation de l’ADN plasmidique
-Le dodécylsulfate du SDS recouvre des complexes contant des parties du chromosome bactérien, des morceaux de la paroi cell et des protéines bactériennes. Ces complexe précipitent quand les ions Na+ sont remplacés par K+
-Fin= centrifugation laissant le surnageant contenant l’ADN plasmidique dépourvu d’ADN génomique (ÉTAPE CLÉ)
-Précipitation de cet ADN avec éthanol ou chromatographie d’affinité (lab avec trousse)

Question 7

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Trousse EZ-10 Spin Column Plasmid DNA MiniPreps Kit

Answer 7

-modification lyse alcaline classique—–»utilise colonne d’affinité à la place d’extraction phénol-Chl
-+ rapide, + efficace, donne ADN plus pur que méthode classique

Question 8

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Conformation de l’ADN plasmidique isolé sur gel d’agarose

Answer 8

-A) Superenroulé
B) Relâchée
C) Linéaire
-Elles migrent à VITESSE DIFFÉRENTES, mais elles ont la même TAILLE

Question 9

3.6 Préparation de l’ADN plasmidique à partir des cultures

Évaluer la qualité et la pureté de l’extraction de l’ADN plasmidique

Answer 9

-Une bonne préparation d’ADN plasmidique contient surtout de l’ADN superenroulé sans contenir de l’ADN génomique ni d’ARN

Question 10

3.7 Quantification des extractions plasmidiques

pk on fait ça?

Answer 10

-Après avoir évalué la qualité et la pureté, il faut que la qte obtenue soit assez grande pour séquencer

Question 11

3.7 Quantification des extractions plasmidiques

NanoDrop 1000

Answer 11

-Purines et pyrimidines absorbent à 260 nm
-Quand ADN est en solution et à l’état pur, on peut quantifier ([]) direct à 260 nm. A260=1 où la [] est de 50 ug/ml
- Il y a le risque de contamination de produit absorbant à 260 nm comme prot(pic à 280 nm) ou phénol (pic à 270 nm)—»surestimation de la concentration en ADN
-RAPPORT A260/A280 pour évaluer la pureté AUSSI IMP
*Si entre 1,,8 et 2,0 = excellent.
*Si plus que 2.0=contamination à ARN
*Si moins que 1,8=Contamination de prot ou phénol
-La spectro ne nous dit pas si ADN est intact ou dégradé (gel d’agarose pour voir la qualité et sa quantité)
-Avant de déterminer la qte sur gel d’agarose, on le fait au spectro

Question 12

3.8 Analyse Assemblage de Gibson par digestion ADN plasmidique avec enzymes de restrictions

Généralités

Answer 12

-Coupe (digestion) plasmide avec enzymes de restrictions et sépare les fragments sur gel d’agarose
-Elles clivent 2 brins d’ADN de séquences spécifiques reconnues (parfois il peut y avoir des nucléotides non-spécifiques)
-Ces séquence reconnues font de 4 à 8 bases, mais en lab on utilise celles qui en reconnaissent 6

Question 13

3.8 Analyse Assemblage de Gibson par digestion ADN plasmidique avec enzymes de restrictions

Enzymes de restrictions

Answer 13

-Isolés de micro-org. Ex: EcoRv viens de E. Coli
-Ces enzymes sont faites de façon recombinantes pour un meilleur rendement et une meilleur purification
-Forme des extrémités: franches, 5’ saillantes et 3’saillantes

Question 14

3.8 Analyse Assemblage de Gibson par digestion ADN plasmidique avec enzymes de restrictions

Facteurs qui influence activité enzymatique

Answer 14

-T (la optimale est de 37 pour ‘incubation, mais chez d’autres ca peut varier entre 25 à 60)
-pH
-Force ionique (Mg+ est essentiel)

Question 15

3.8 Analyse Assemblage de Gibson par digestion ADN plasmidique avec enzymes de restrictions

Utilité enzyme de restrictions

Answer 15

-Caractérise tout ADN—» l’ADN est coupé ou pas en un ou plrs fragments SPÉCIFIQUE dépendamment le nb de sites de clivages de l’enzyme retrouvé sur l’ADN
-Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à un pH légèrement basique (ON FAIT LE GEL À CET ÉTAPE)

Question 16

3.9 Séquençage d’un candidat potentiel de l’assemblage de Gibson

Généralités

Answer 16

-Séquençage pour déterminer succession de nucléotides sur molécule d’ADN. On utilise ADN poly, des enzymes capables de faire un brin complémentaire à partir d’un brin matrice
Séquençage de génome (séquençage de nouvelle génération): génération massive de données de séquences rapidement
Séquençage d’un fragment d’ADN après clonage moléculaire: méthode de SANGER

Question 17

3.9 Séquençage d’un candidat potentiel de l’assemblage de Gibson

Méthode de Sanger

Answer 17

-Séparation de fragment d’ADN selon taille pour avoir ordre de nucléotides de la séquence
-Grâce à blocage de la croissance d’une chaîne de polymérisation grâce à incorporation de ddNTP (analogues de dNTP) provoquant la fin de l’élongation
-Les ddNTP et les dNTP sont mélangés avec la matrice d’ADN à séquencer (des fragments de différentes tailles obtenues)
-On utilise une amorce qui peut s’hybrider sur un endroit spécifique pour générer des molécules d’ADN synthétisés toutes au même endroit
-les ddNTP sont lié de façon covalente à un agent fluorescent de couleur différentes.
-Méthode: Électrophorèse capillaire sur gel pour classer les fragments selon leur tailles et la fluo émise est analysé sur ordi. voit les résultats sur le chromatogramme
-Bref, séquencer fragment de 600 à 100 pab
-Il est possible de faire plusieurs réaction de séquençage quand la séquence est longue

Question 18

3.10 Expression de la LDHA-6xHis chez E.Coli

Généralités

Answer 18

-Developpement et prod de prot imp pour lutter contre maladie
-Production de prot recombinante: prot bioactives produite des versions manipulées des protéines natives grâce à l’introduction d’ADN recombinant dans un vecteur (clonage)

Question 19

3.10 Expression de la LDHA-6xHis chez E.Coli

Un système d’expression

Answer 19

-choisi en fct du type de prot, de la fonction de la prot et du rendement requis
-Exemple: Le système d’expression de E. Coli ne permet pas ajout de modif post-trad comme phosphorylation et glycolysation impliqué dans le repliement, stabilité et l’activité biologique des protéines. Avantage de E.Coli: production rapide de protéines recombinantes en grande qte et à faible coût

Question 20

3.10 Expression de la LDHA-6xHis chez E.Coli

Système qu’on utilise en lab: Système d’expression de l’opéron arabinose

Answer 20

-produire une grande qte de LDHA-6xHis afin de faire sa purification avec 6xHis et utiliser pour projet 4
-Lorsqu’un gène est cloné en aval de pBAD (promoteur), l’expression de ce gène est controlée par AraC (prot)
-Quand pas d’Arabinose, AraC se dimérise et bloque accès du promoteur à l’ARN poly (forme une boucle d’ADN entre 2 sites de contrôle distants)—-»pas de protéines produite clonée en aval de pBAD
- Quand Arabinose, il se lie au dimère de protéine AraC et la structure de AraC change—»ARN poly lie pBAD—–»transcription
*Dans le lab c’est araBAD

Question 21

3.11 Purification LDH5-6xHis sur résine Ni-NTA

Généralité

Answer 21

-Purification des prot avec étiquette 6xHis—»affinité des résidus His pour des ions métalliques (Ni2+ ou Cu2+) qui sont immobilisés sur une matrice grâce à un ligand chélateur d’ions
-Agent chélateur le plus souvent utilisé NTA
-Adsorption de prot d’intérêt doit être réversible pour la récupérer
-Ajout d’imidazole pour faire compétition aux ions métalliques et prot étiquetées sont détachées (CHROMATOGRAPHIE IMAC)

Question 22

3.11 Purification LDH5-6xHis sur résine Ni-NTA

Procédure

Answer 22

1.Adsorption des résidus histidine (et donc de la prot) qui se lie à ion métallique Ni qui lui est lié à NTA sur la matrice
2. Le mélange est chargé dans une colonne de chromatographie vide
3. Ajout de faible quantité d’imidazole pour se débarrasser des protéines liées avec faible affinité
4.Protéine d’intérêt est éluée en augmentant la concentration d’imidazole

Question 23

3.12 Analyse de la purification de la LDH5–6xHis sur gel SDS-PAGE Stain-Free

Généralités

Answer 23

-Visualisation des prot SANS colorant
-Évalue séparation, qualité, qte
-Grâce présence de composé trihalo dans la matrice du gel
-Les rayons UV créent des pontages chimiques entre Trp des protéines et les trihalo de la matrice —»fait de la fluo et détection bande du gel

Question 24

3.12 Analyse de la purification de la LDH5–6xHis sur gel SDS-PAGE Stain-Free

Avantages technologie Stain-Free

Answer 24

-Utilise un gel visualisé pour d’autres application comme Immunobuvardage contrairement au Bleu de Coomassie—»Après transfert, on peut même détecter les produits sur la membrane et aussi analyser l’efficacité du transfert avant de faire l’immuno
-Pas d’étape de décoloration du gel
-Sensibilité équivalente ou plus que celle avec bleu de Coomassie
-Sans danger pour l’environnement

Question 25

3.13 Détermination concentration protéique de la LDH5-6xHis par absorbance à 280nm

Généralités

Answer 25

-Approximatif et rapide pour déterminer [prot] et acide nucléique à partir d’absorbance à 280 et 260 nm.
-Les a-a Tyr et Trp absorbent à 278 nm
-Absorbance à 280 —-»utilisé pour chromatographie liquide pour suivre élution prot
-50 fois moins sensible que Bradford et solution doivent contenir moins que 20% d’acide nucléiques.
voir l’activité de nos trois élution