Projet 3 théorie partie 1 Flashcards
3.1 Assemblage de Gibson
But:
Assembler plusieurs fragments d’ADN de tailles variables sans utiliser d’enzymes de restrictions où il est possible d’assembler plusieurs fragments en un plasmide circulaire, dans une réaction à 50༠C.
3.1 Assemblage de Gibson
Gibson dépend de 3 enzymes
Exonucléase T5 : enlève les nt en 5’ double brin ce qui génère des extensions 3’ simple brin.
ADN polymérase: Synthétise le 2e brin d’ADN à partir des extrémités 3’ et remplit les trous entre les fragments à rassembler.
ADN ligase : scelle les 2 fragments d’ADN pour compléter l’assemblage.
*** L’exonucléase T5 est thermosensible.
3.1 Assemblage de Gibson
Clonage de la LDHA humaine par assemblage de Gibson
Objectif d’exprimer une grande quantité de la protéine recombinante humaine chez E. Coli pour ensuite purifier et faire des essais enzymatiques de dosage en présence de différents inhibiteurs.
On ajoute une étiquette histidine (His-Tag) pour aider à la lecture de la séquence codante de la LDHA à sa partie C-terminale.
His-tag à 6aa histidines consécutifs ce qui permet un lien à la résine par NI-NTA pour faire une chromatographie d’affinité.
L’expression du 6xHis-LDHA est possible grace à un système d’expression inductible à l’arabinose.
3.1 Assemblage de Gibson
PCR de l’insert
-Séquence codante de la LDHA-GxHis dont son ADNc est présent dans plasmide pLDHA
-Amorce antisens (en 3’) va permettre ajout de l’étiquette 6xHis (contient séquence codante pour cette étiquette)
-Amorce sens et artisans contiennent séquence d’homologies de 25 pb (pour assemblage avec PCR Vecteur
3.1 Assemblage de Gibson
PCR vecteur
-vecteur pGLO sans séquence avec GFP
-Le produit de amplification, grâce au vecteur aura: Origine de réplication, gène résistance à Ampicilline (AmpR) et système d’expression à l’arabinose avec pBAD.
-Amorce sens et antisens de pGLO séquences d’homologies de 25 pb pour qu’il y ait assemblage avec le fragment du PCR de l’insert
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
PCR avantages
-Permet de produire beaucoup de copies de séquences d’ADN spécifiques sans avoir recours à des étapes de clonage et de détection.
-Diagnostique de maladies infectieuses
-Détection de traces d’évènements pathologiques (Mutations qui lient au cancer)
-Enquêtes judiciaires
-Amplification d’ARN
-Mutagénèse dirigée
-Paléontologie moléculaire
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
PCR how; ADN polymérase
-Principe basé sur le fonctionnement cyclique d’une ADN polymérase. Cette enzyme allonge l’extrémité 3’ d’un court brin d’ADN lié à un brin plus long. L’ADN polymérase ajoute les nucléotides complémentaires à la matrice.
-PCR = n cycles successifs d’amplification.
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
PCR étapes
Dénaturation de l’ADN matrice (95༠C)
Hybridation des amorces (40-72༠C)
Élongation par l’ADN polymérase (72༠C).
Suite à l’élongation les amorces sont intégrées dans la séquence amplifiée. Le nombre de molécules d’ADN double à chaque cycle, 2n. On fait entre 20-35 cycles.
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
ADN polymérase thermostable
ADN polymérase qui ne dénature pas à chaque cycle à 95༠C, donc pas besoin d’en ajouter à chaque cycle. Ex: polymérase Taq, résistante jusqu’à 100༠C
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
SI……
-Une haute fidélité est requise,
-Le fragment à amplifier est plus long que quelques milliers de paires de bases,
-On est en train de faire des clonages d’ARNm par PCR.
-proofreading
-On utilise une combinaison de polymérases thermophiles pour une augmentation de rendement. -On peut aussi ajouter formamide, DMSO ou glycérol à une matrice riche en GC pour augmenter le rendement.
Exemples: ADN polymérase Taq, Pfu-PLUS, Pwo, Deep Vent, Vent.
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
Les variables PCR
-Plus l’ADN matrice est long, plus le temps de dénaturation doit être long.
-Plus il y a de GC, plus c’est difficile de dénaturer la séquence.
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
Rôle du Mg2+
-Forment des complexes solubles avec les DNTPs et avec l’ADN.
-Une qté adéquate est importante pour l’élongation.
-Si on manque de Mg, on aura peu de produits formés.
-Si trop de Mg, formation de produits NON spécifiques.
-Normalement 1,5 mM de MgCl2 est bon.
3.2 Amplification des fragments d’ADN par PCR
On utilise quelle polymérase dans notre laboratoire?
Pour un assemblage de Gibson, il est nécessaire d’utiliser une polymérase à haute-fidélité, pour éviter d’introduire des mutations. Alors, on utilise la polymérase Pfu-PLUS, qui a un rendement 50X meilleur que la Taq.
3.3 Gel d’agarose
Explique les généralités de cette méthode
Électrophorèse sur gel d’agarose = méthode de choix pour la séparation, la purification & l’identification des fragments d’ADN et d’ARN.
-Sous l’influence d’un courant électrique, les acides nucléiques chargés négativement (phosphates dans la structure) se déplacent vers la borne positive (anode) dans le gel.
-Les molécules ne migrent pas tous à la même vitesse, alors elles seront séparées puisqu’elles migrent par rapport à leur taille. Plus la molécule est grosse, moins elles migrent rapidement. La conformation des molécules influence aussi la migration.
3.3 Gel d’agarose
Les 4 paramètres
- Taille moléculaire de l’ADN
Grosses molécules = migrent lentement
Petites molécules = migrent rapidement
2.Concentration d’agarose
Possible de séparer un grand nombre de fragments dans des gels de différentes concentrations.
3.Conformation de l’ADN
l’ADN superenroulé, plasmidique et relâché migre à différentes vitesses.
4.le courant appliqué (max 5V/cm)
Voltage bas = meilleure différenciation
haut voltage = réduction de la séparation
