Projet 2 théorie

Question 1

Extraction LDH: préparation d’extrait brut de tissu animal-Principe

Answer 1

-Homogénise mécaniquement tissu=détruire cellules et disperser leur contenu dans tampon aqueux
-Homogénat se fait avec appareil Poltron (constitué moteur qui contrôle vitesse de rotation de parcelles de métal sur tige creuse métallique)
-Boryage tissus robuste comme coeur et muscle
-Clarifie homogénat par centri pour élire les morceaux de tissuss mal broyés et constituants cellulaires insolubles

Question 2

Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- principe

Answer 2

-Sépare protéines en solution selon capacité de leurs réduits chargés à interagir avec une phase stationnaire de charge opposée. La phase stationnaire peut être chargée + ou -

Question 3

Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- dans le cas du lac…

Answer 3

La résine est chargée positivement. C’est une échanges d’anions. Elle retiens groupement acide COO- et ions negatifs l’inverse se fait aussi

La liaison d’une protéine dépends du pH du tampon dans lequel elle est dissoute. pH du slv doit être une unité de pH inférieur ou supérieur au pI de prot pour charge nette soit différente.

Nous il faut que pH soit supérieur (basique= charge -) à pI pour se lier à colonne.

Après on élue protéine d’intérêt en augmentant concentration de sel du tampon ou en changeant le pH progressivement

Question 4

Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- composition de notre colonne

Answer 4

résine échanges d’anions dont phase stationnaire est composée de cellulose (sephacel) et un gr fonctionnel lié de façon convalesce et chargé positivement (DEAE) la ou se lie prot

Question 5

Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- isoenzymes de LDH

Answer 5

LDH=tétramère dont sous-unités sont codées par diff gènes (Idha,ldhb,ldhc)

Une sous-unité (monomère) diffèrent selon leur a-a et leur activité catalytique. Ils ont des poids moléculaire comparable

Question 6

Type de isoenzymes LDH

Answer 6

Monomère M: type musculaire
Monomère H: type cardiaque
Monomère C: testicules

ex: LDH-5 (MMMM) est niveau musculaire et LDH-1 (HHHH) niveau cardiaque

crise cardiaque, cancer, exercice extrême change taux de LDH et ration des izoenzymes

Lab: Isoenzyme LDH-4 muscle et foie

Question 7

Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Principe

Answer 7

Étapes plus spécifique!
technique de séparation pour purifier presque toutes les molécules biologiques selon leur fonction ou leur structure chimique individuelle

Chromatographie d’adsorption dans laquelle la molécule à purifier est adsorbée spécifiquement de façon réversible par un ligand immobilisé sur une matrice

Question 8

Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-La résine

Answer 8

-Colorant bleu de Cibacron F3G-A fixé de façon covalente à un gel d’agarose réticulé (6%)
-Plusieurs protéines ont affinitémpour ce colorant. Ces protéines se combine de façon biospécifique au colorant en raison de sa structure similaire au NAD+

Question 9

Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Les autres protéines ayant de l’affinité

Answer 9

Albumine et interféron se combinent de façon moins spécifique
-Interaction électrostatiques et/ou hydrophobes avec ligand anionique aromatique.

Question 10

Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Élution de protéines liées spécifique en non-spécifique

Answer 10

Spécifique: sont éludées par de faibles concentrations en cofacteurs libres

Non-spécifique: Besoin de grande concentration en cofacteur ou en sel

Question 11

Activité de la LDH-Principe de la réaction

Question 12

Activité de la LDH-comment on peut suivre la réaction

Answer 12

Grâce à la propriété du NADH d’absorber la lumière à 340m

donc 1 unité de LDH=qte requise de LDH pour convertir 1umol de NADH par min, à T pièce et à pH 7,4

TEMPS EST CONTINU: vérifier àa linéarité de la réaction pour s’assurer que l’activité enzymatique représente Vo

Question 13

Activité de la LDH-Calcul via Béer-Lambert

Answer 13

p.15 et 16

Question 14

Bilan de purification-Généralités

Answer 14

-informe sur l’efficacité des étapes de purifications
-montre comment chaque étape a participé pour enrichir notre enzyme selon les prot contaminantes (facteur de purification) et selon ce qui reste de la protéine d’intérêt (rendement)

Question 15

Bilan de purification- Définition activité spécifique

Answer 15

Def: Activité de l’enzyme par rapport à la quantité totale de protéines dans l’échantillon

unités/mg de prot.

C’est le paramètre qui faut faire un dosage enzymatique

Dosage enzymatique spécifique à prot tandis que le protéique non mais quantifie l’ensemble des prots

Question 16

Bilan de purification- Facteur de purification

Answer 16

Représente le nb de fois l’activité spécifique a augmenté d’une étape par rapport à une étape précédente. Sa valeur devrait augmenter selon la purification

Question 17

Bilan de purification- Rendement

Answer 17

Évalue la perte (en %) de l’enzyme au cours de la purification. La valeur diminue car il y a perte de matériel

Question 18

Dosage de protéines-Méthode de Bradford

Answer 18

Repose sur le changement du pic d’absorption maximal (de 465 à 595) nm du colorant bleu de Coomassie lorsqu’il interagit avec a-a basiques et aromatique des prot.

Méthode linéaire seulement pour une courte échelle de concentration protéique

Question 19

Gel SDS-PAGE-Principe

Answer 19

permet de visualiser des protéines
après qu’elles aient été séparées dans un gel.

Cette approche peut être utilisée pour estimer la quantité de
protéines dans un mélange et le degré de pureté d’une protéine purifiée.

Question 20

Gel SDS-PAGE-décrit ce qu’il se passe en étape

Answer 20

1.en présence de SDS (SDS-PAGE), les échantillons protéiques sont d’abord
dénaturés par chauffage à 95°C en présence d’un détergent, le dodécyl sulfate de sodium (SDS), et d’un agent réducteur des ponts disulfures, le β mercaptoéthanol.

2.Sous de telles conditions, les sous-unités d'une protéine
se dissocient et le SDS se lie aux chaînes peptidiques en quantité grossièrement proportionnelle à leur poids
moléculaire (1,4 g SDS/g polypeptide). Le SDS lié confère une charge négative nette importante qui rend la
charge intrinsèque de la protéine insignifiante.Les protéines ainsi chargées négativement sont séparées selon
leur poids moléculaire et migrent vers l'électrode chargée positivement (anode). La vitesse de migration à
travers le gel poreux de polyacrylamide est inversement proportionnelle à la taille du polypeptide

Question 21

Gel SDS-PAGE-Quel système on utilise ?

Answer 21

un système discontinu de tampon.
Dans ce système, les échantillons migrent d'un gel de polyacrylamide très poreux (gel de concentration) vers
un gel de polyacrylamide moins poreux (gel de séparation).

Question 22

Gel SDS-PAGE-autre différence des gels de concentration et séparation

Answer 22

De plus, le gel de concentration diffère du gel de
séparation au niveau de son pH et de sa composition ionique.Ceci a pour effet de concentrer les échantillons
de protéines avant qu'ils ne pénètrent le gel de séparation, améliorant ainsi la résolution des bandes.

Question 23

Gel SDS-PAGE- Détection des protéines

Answer 23

Visualisation: le gel peut être coloré avec le bleu de Coomassie. Ce colorant se lie à certains acides aminés
basiques (arginine, histidine et lysine) et à des résidus aromatiques comme la tyrosine et le tryptophane.

Détection prot spécifique
Pour
la détection de protéines spécifiques, le SDS-PAGE peut être suivi de la technique d'immunobuvardage, où les
protéines seront transférées du gel à une membrane et détectées spécifiquement à l'aide d'anticorps.

Question 24

Immunobuvardage de type western-Principe

Answer 24

séparer les protéines en fonction de leur taille par électrophorèse sur
gel SDS-PAGE, puis à les transférer du gel à une membrane sur laquelle elles se fixent.

Question 25

Immunobuvardage de type western-Les étapes

Answer 25

Certaines protéines
(antigènes) peuvent alors être spécifiquement reconnues par des anticorps primaires. On utilise ensuite un
anticorps secondaire dirigé contre la portion constante (Fc) de l'anticorps primaire afin de détecter les complexes
antigènes-anticorps. Pour ce faire,l'anticorps secondaire est couplé à un marqueur visible (fluorophore, biotine,
enzyme,etc.

Question 26

Immunobuvardage de type western-transfert des protéines

Answer 26

1.protéines sont encore chargées négativement dans le gel SDS-PAGE, nous utilisons cette propriété
pour faire migrer les protéines du gel vers la membrane grâce à l'application d'un courant électrique.

2. Dans notre laboratoire: un transfert semi-sec. Le montage se
   retrouve entre deux feuilles épaisses de papier filtre imbibées de tampon. Ce type d'appareil permet d'effectuer
   un transfert rapidement avec très peu de tampon et à un courant électrique réduit. Il faut cependant s'assurer
   que la membrane ne s'assèche pas, ce qui pourrait affecter le transfert des protéines.

Question 27

Immunobuvardage de type western- Détection immunologique

Answer 27

l'anticorps secondaire utilisé est couplé à une enzyme : la peroxydase de raifort (HRP). En
présence de peroxyde d'hydrogène (H2O2), cette enzyme oxyde un substrat chromogénique : le 4-chloro-1-
naphtol. Le produit oxydé est insoluble et forme un précipité coloréà l'emplacement des complexes immuns sur
la membrane de nitrocellulose