Projet 2 théorie Flashcards
Extraction LDH: préparation d’extrait brut de tissu animal-Principe
-Homogénise mécaniquement tissu=détruire cellules et disperser leur contenu dans tampon aqueux
-Homogénat se fait avec appareil Poltron (constitué moteur qui contrôle vitesse de rotation de parcelles de métal sur tige creuse métallique)
-Boryage tissus robuste comme coeur et muscle
-Clarifie homogénat par centri pour élire les morceaux de tissuss mal broyés et constituants cellulaires insolubles
Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- principe
-Sépare protéines en solution selon capacité de leurs réduits chargés à interagir avec une phase stationnaire de charge opposée. La phase stationnaire peut être chargée + ou -
Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- dans le cas du lac…
La résine est chargée positivement. C’est une échanges d’anions. Elle retiens groupement acide COO- et ions negatifs l’inverse se fait aussi
La liaison d’une protéine dépends du pH du tampon dans lequel elle est dissoute. pH du slv doit être une unité de pH inférieur ou supérieur au pI de prot pour charge nette soit différente.
Nous il faut que pH soit supérieur (basique= charge -) à pI pour se lier à colonne.
Après on élue protéine d’intérêt en augmentant concentration de sel du tampon ou en changeant le pH progressivement
Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- composition de notre colonne
résine échanges d’anions dont phase stationnaire est composée de cellulose (sephacel) et un gr fonctionnel lié de façon convalesce et chargé positivement (DEAE) la ou se lie prot
Colonne DEAE Sephacel (chromatographie échangeuses d’ions)- isoenzymes de LDH
LDH=tétramère dont sous-unités sont codées par diff gènes (Idha,ldhb,ldhc)
Une sous-unité (monomère) diffèrent selon leur a-a et leur activité catalytique. Ils ont des poids moléculaire comparable
Type de isoenzymes LDH
Monomère M: type musculaire
Monomère H: type cardiaque
Monomère C: testicules
ex: LDH-5 (MMMM) est niveau musculaire et LDH-1 (HHHH) niveau cardiaque
crise cardiaque, cancer, exercice extrême change taux de LDH et ration des izoenzymes
Lab: Isoenzyme LDH-4 muscle et foie
Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Principe
Étapes plus spécifique!
technique de séparation pour purifier presque toutes les molécules biologiques selon leur fonction ou leur structure chimique individuelle
Chromatographie d’adsorption dans laquelle la molécule à purifier est adsorbée spécifiquement de façon réversible par un ligand immobilisé sur une matrice
Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-La résine
-Colorant bleu de Cibacron F3G-A fixé de façon covalente à un gel d’agarose réticulé (6%)
-Plusieurs protéines ont affinitémpour ce colorant. Ces protéines se combine de façon biospécifique au colorant en raison de sa structure similaire au NAD+
Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Les autres protéines ayant de l’affinité
Albumine et interféron se combinent de façon moins spécifique
-Interaction électrostatiques et/ou hydrophobes avec ligand anionique aromatique.
Colonne Blue Sepharose (chromatographie d’affinité)-Élution de protéines liées spécifique en non-spécifique
Spécifique: sont éludées par de faibles concentrations en cofacteurs libres
Non-spécifique: Besoin de grande concentration en cofacteur ou en sel
Activité de la LDH-Principe de la réaction
Activité de la LDH-comment on peut suivre la réaction
Grâce à la propriété du NADH d’absorber la lumière à 340m
donc 1 unité de LDH=qte requise de LDH pour convertir 1umol de NADH par min, à T pièce et à pH 7,4
TEMPS EST CONTINU: vérifier àa linéarité de la réaction pour s’assurer que l’activité enzymatique représente Vo
Activité de la LDH-Calcul via Béer-Lambert
p.15 et 16
Bilan de purification-Généralités
-informe sur l’efficacité des étapes de purifications
-montre comment chaque étape a participé pour enrichir notre enzyme selon les prot contaminantes (facteur de purification) et selon ce qui reste de la protéine d’intérêt (rendement)
Bilan de purification- Définition activité spécifique
Def: Activité de l’enzyme par rapport à la quantité totale de protéines dans l’échantillon
unités/mg de prot.
C’est le paramètre qui faut faire un dosage enzymatique
Dosage enzymatique spécifique à prot tandis que le protéique non mais quantifie l’ensemble des prots
Bilan de purification- Facteur de purification
Représente le nb de fois l’activité spécifique a augmenté d’une étape par rapport à une étape précédente. Sa valeur devrait augmenter selon la purification
Bilan de purification- Rendement
Évalue la perte (en %) de l’enzyme au cours de la purification. La valeur diminue car il y a perte de matériel
Dosage de protéines-Méthode de Bradford
Repose sur le changement du pic d’absorption maximal (de 465 à 595) nm du colorant bleu de Coomassie lorsqu’il interagit avec a-a basiques et aromatique des prot.
Méthode linéaire seulement pour une courte échelle de concentration protéique
Gel SDS-PAGE-Principe
permet de visualiser des protéines
après qu’elles aient été séparées dans un gel.
Cette approche peut être utilisée pour estimer la quantité de
protéines dans un mélange et le degré de pureté d’une protéine purifiée.
Gel SDS-PAGE-décrit ce qu’il se passe en étape
1.en présence de SDS (SDS-PAGE), les échantillons protéiques sont d’abord
dénaturés par chauffage à 95°C en présence d’un détergent, le dodécyl sulfate de sodium (SDS), et d’un agent réducteur des ponts disulfures, le β mercaptoéthanol.
2.Sous de telles conditions, les sous-unités d'une protéine
se dissocient et le SDS se lie aux chaînes peptidiques en quantité grossièrement proportionnelle à leur poids
moléculaire (1,4 g SDS/g polypeptide). Le SDS lié confère une charge négative nette importante qui rend la
charge intrinsèque de la protéine insignifiante.Les protéines ainsi chargées négativement sont séparées selon
leur poids moléculaire et migrent vers l'électrode chargée positivement (anode). La vitesse de migration à
travers le gel poreux de polyacrylamide est inversement proportionnelle à la taille du polypeptide
Gel SDS-PAGE-Quel système on utilise ?
un système discontinu de tampon.
Dans ce système, les échantillons migrent d'un gel de polyacrylamide très poreux (gel de concentration) vers
un gel de polyacrylamide moins poreux (gel de séparation).
Gel SDS-PAGE-autre différence des gels de concentration et séparation
De plus, le gel de concentration diffère du gel de
séparation au niveau de son pH et de sa composition ionique.Ceci a pour effet de concentrer les échantillons
de protéines avant qu'ils ne pénètrent le gel de séparation, améliorant ainsi la résolution des bandes.
Gel SDS-PAGE- Détection des protéines
Visualisation: le gel peut être coloré avec le bleu de Coomassie. Ce colorant se lie à certains acides aminés
basiques (arginine, histidine et lysine) et à des résidus aromatiques comme la tyrosine et le tryptophane.
Détection prot spécifique
Pour
la détection de protéines spécifiques, le SDS-PAGE peut être suivi de la technique d'immunobuvardage, où les
protéines seront transférées du gel à une membrane et détectées spécifiquement à l'aide d'anticorps.
Immunobuvardage de type western-Principe
séparer les protéines en fonction de leur taille par électrophorèse sur
gel SDS-PAGE, puis à les transférer du gel à une membrane sur laquelle elles se fixent.
Immunobuvardage de type western-Les étapes
Certaines protéines
(antigènes) peuvent alors être spécifiquement reconnues par des anticorps primaires. On utilise ensuite un
anticorps secondaire dirigé contre la portion constante (Fc) de l'anticorps primaire afin de détecter les complexes
antigènes-anticorps. Pour ce faire,l'anticorps secondaire est couplé à un marqueur visible (fluorophore, biotine,
enzyme,etc.
Immunobuvardage de type western-transfert des protéines
1.protéines sont encore chargées négativement dans le gel SDS-PAGE, nous utilisons cette propriété
pour faire migrer les protéines du gel vers la membrane grâce à l'application d'un courant électrique.
- Dans notre laboratoire: un transfert semi-sec. Le montage se
retrouve entre deux feuilles épaisses de papier filtre imbibées de tampon. Ce type d'appareil permet d'effectuer
un transfert rapidement avec très peu de tampon et à un courant électrique réduit. Il faut cependant s'assurer
que la membrane ne s'assèche pas, ce qui pourrait affecter le transfert des protéines.
Immunobuvardage de type western- Détection immunologique
l'anticorps secondaire utilisé est couplé à une enzyme : la peroxydase de raifort (HRP). En
présence de peroxyde d'hydrogène (H2O2), cette enzyme oxyde un substrat chromogénique : le 4-chloro-1-
naphtol. Le produit oxydé est insoluble et forme un précipité coloréà l'emplacement des complexes immuns sur
la membrane de nitrocellulose
