Projet 3 théorie Flashcards
Assemblage de Gibson-Principe
permet d'assembler plusieurs fragments ADN
de tailles variables sans l'utilisation d'enzymes de restriction ou de sites de clivages compatibles.
Des extrémités
superposées définies par l'expérimentateur (régions _d'homologies d'environs 15 à 30 pb) sont incorporées
dans les fragments pour permettre l'assemblage avec des fragments adjacents.
Tout à 50 degrés
Assemblage de Gibson- 3 enzymes
1) L'exonucléase T5 enlève tout d'abord les nucléotides à partir des extrémités 5' des molécules d'ADN
doubles brins générant ainsi des extensions 3' simples brins. Les fragments d'ADN homologues générés
peuvent alors s'hybrider les uns aux autres; (L'exonucléase T5 utilisé dans le mélange réactionnel est thermosensible. Durant l'incubation à50℃,elle est
inactivée avec le temps afin d'éviter la dégradation complète des fragments à assembler.)
2) Par la suite,une ADN polymérase synthétise le 2e brin de l'ADN à partir des extrémités 3' et remplie les «
trous » entre les fragments à assembler;
3) Finalement,une ADN ligase va sceller (joindre) les deux fragments d'ADN pour compléter l'assemblage.
Assemblage de Gibson-CLONAGE DE LA LDHA HUMAINE PAR ASSEMBLAGE DE GIBSON (en général ce qu’on fait dans projet 3)
clonage a pour objectif d'exprimer une grande
quantité de la protéine recombinante humaine chez E. coli pour ensuite la purifier (LDH)
étiquette histidine (His-tag) sera ajoutée dans le cadre de lecture de la séquence codante de la LDHA à sa
partie C-terminale. la liaison à de la résine NI-NTA afin d'y effectuer sa purification par chromatographie d'affinité
L'expression de la LDHA-6xHis sera possible grâce à un système d'expression inductible à l'arabinose
Assemblage de Gibson-1re étape: amplifier par PCR les 2 fragments Lesquels?
- PCR de l’insert la séquence codante de la LDHA humaine (LDHA CDS) dont son ADN
complémentaire (ADNc) est présent dans le plasmide pLDHA. Lors de cette amplification, l'amorce située en 3’ (LDHA-6xHis antisens) permettra l'ajout d'une étiquette de purification 6xHis car elle contiendra la
séquence codante pour cette étiquette. Les deux amorces contiennent des séquences d'homologies de 25
pb pour permettre l'assemblage de ce fragment avec celui du PCR vecteur
2.PCR du vecteur
vecteur pGLO sans la séquence codante pour la GFP. Le produit de cette
amplification contiendra une origine de réplication (ori), le gène de résistance àl'ampicilline (AmpR)
permettant de sélectionner des transformants sur un milieu contenant l'antibiotique ampicilline (voir le
Protocole M pour plus de détails) ainsi que le système d'expression à l'arabinose pBAD (gène araC +
promoteur inductible araBAD; voir le Protocole Q). Les deux amorces contiennent des séquences
d'homologies de 25 pb pour permettre l'assemblage de ce fragment avec celui du PCR de l'insert
Amplification PCR-Définition et c’est utilisé pk?
-permet de produire un nombre gigantesque de copies de séquences d'ADN
spécifiques sans pour autant avoir recours à des étapes de clonage et de détection.
Utilisé pour diagnostic rapide de
maladies infectieuses, la détection de traces d'événements pathologiques (comme les mutations pouvant
conduire au cancer), les enquêtes judiciaires, l'amplification d'ARN (après l'avoir converti en ADNc à l'aide
d'une transcriptase inverse), la mutagenèse dirigée et la nouvelle science de la paléontologie moléculaire
(études des séquences fossiles).
Amplification PCR-Principe
permet de sélectionner et d'amplifier à volonté n'importe quelle séquence d'un mélange de
fragments d'ADN (Figure 4). Son principe est basé sur le fonctionnement cyclique d'une ADN polymérase.
Cette enzyme peut allonger l'extrémité 3' d'un court brin d'ADN (un oligonucléotide qui sert comme amorce)
lorsqu'il est lié à une matrice d'ADN plus longue. L'ADN polymérase ajoute les nucléotides complémentaires à
ceux de la matrice. La technique PCR consiste à effectuer n cycles successifs d'amplification, au cours desquels
l'ADN polymérase allonge deux amorces entre deux points donnés d'une molécule d'ADN.
Amplification PCR-Étapes
une dénaturation de l'ADN matrice (95 °℃);
une hybridation (ou appariement) des amorces (40-72 °C) et une extension des amorces par l'ADN polymérase
(72 °C).
À la fin de l'étape d'extension, les amorces sont physiquement intégrées dans la séquence totale
amplifiée. Après un cycle d'amplification, le produit d'extension nouvellement formé peut être utilisé comme
matrice dans le prochain cycle. Le nombre de molécules d'ADN va donc approximativement doubler à chaque
cycle. De cette façon, la répétition successive de 20 à 35 cycles d'amplification permet d'obtenir une quantité
très appréciable de la séquence choisie
Amplification PCR-ADN polymérase précision
il faudra rajouter de l'ADN polymérase à chaque cycle, car celle déjà
présente dans la réaction perdra son activité enzymatique pendant l'étape de dénaturation à 95℃ du prochain
cycle. C'est la découerte des ADN polymérases thermostables qui a vraiment déclenché le pouvoir de la
technique d'amplification par la PCR en permettant à la technique d'être automatisée, car leur utilisation
permet jusqu'à 35 cycles consécutifs d'amplification sans avoir besoin de rajouter de l'enzyme.
Amplification PCR-Donne un exemple de ADN poly thermostable
La première ADN polymérase thermostable à être utilisée à ces fins était la polymérase Taq qui est isolée de la bactérie
Thermus aquaticus, une espèce vivante dans les sources chaudes. Plusieurs ADN polymérases thermostables, qui varient
dans leur fidélité, leur efficacité et leur capacité de synthétiser de larges fragments d'ADN, sont maintenant disponibles.
Cependant, pour les applications de routine, la polymérase Taq demeure toujours l'enzyme de choix pour l'amplification
Amplification PCR-Problème de la Taq polymérase
Quand il y a lacune:
Spécifiquement, si une haute-fidélité est requise, si le fragment à amplifier est plus de quelques milliers de
paires de bases en longueur, ou si on est en train d'effectuer des clonages d'ARNm par la technique de la RT-
PCR (amplification de l'ADNc, produit par la transcription inverse d'un ARNm, par la PCR), d'autres ADN
polymérases thermostables peuvent apporter des avantages significatifs.
Amplification PCR-Solution lacunes Taq
- si le but est de
reproduire exactement le gène d'intérêt, on choisira une enzyme avec une fonction de « proofreading » pour
s'assurer d'une amplification fidèle, c'est-à-dire sans erreur.
2.Pour certaines applications, l'utilisation d'un
mélange de deux ADN polymérases thermostables entraîne une augmentation du rendement, surtout pour
l'amplification des cibles plus longues.
D’autres exemples d’ADN poly thermostable: l'ADN polymérase Taq, l'ADN polymérase Pfu-PLUS, l'ADN polymérase Pwo, l'ADN
polymérase Vent et l'ADN polymérase Deep Vent.
Amplification PCR-autre variables
entre autres,le temps de
dénaturation, la température d'hybridation (ou appariement), les séquences des amorces,le temps
d'extension, la [Mg2+] (voir plus bas) et le nombre de cycles choisis.
Amplification PCR, longueur brin, Tm et GC séquence
Plus l'ADN matrice est long, plus le
temps de dénaturation doit être important. Le contenu en G +C est aussi important à considérer, car les
séquences riches en G + C sont plus difficiles à dénaturer. La température d'hybridation est critique:
l'utilisation d'une température trop haute provoque une hybridation inefficace des amorces, réduisant ainsi
le rendement alors que l'utilisation d'une température trop basse provoque une hybridation non-spécifique
des amorces, entraînant l'amplification de fragments non désirés. En règle générale, la température
d'hybridation d'une amorce est de 3 à 5 ℃inférieure à sa température de fusion
Pour Tm voir formule calcul p.7 Projet 3
Amplification PCR décrit l’efficacité de la Taq Polymérase
synthétise environ 2000 nt/min à sa température optimale (72-78℃) et
généralement, l'étape de polymérisation est de 1 min par 1000 pb du produit.
Amplification PCR-différence entre amplifier dans plasmide vs dans ADN génomique
moins de cycles seront nécessaires pour
amplifier un fragment à partir d'un plasmide que pour amplifier le même fragment de l'ADN génomique, car le
nombre de copies de la cible présent est beaucoup plus élevé dans le cas du plasmide (pour la même quantité
d'ADN).Il faut éviter de faire trop de cycles, car le risque d'amplifier un fragment non désiré augmente avec le
nombre de cycles.
Amplification PCR- Comment améliorer le rendement de l’amplification
l'ajout de faibles concentrations de certains produits, comme le formamide, le
DMSO et le glycérol, aux amplifications par la PCR de matrices riches en G+C peut augmenter le rendement. En
revanche, il est toujours préférable d'optimiser les concentrations des composants réguliers d'une amplification
par la PCR, surtout celles de Mg+ et K+,avant d'essayer ces produits.
Amplification PCR-Role du Mg2+
les ions Mg2+ forment des complexes solubles avec les dNTP et avec l'ADN. Ce sont
ces complexes qui constituent les véritables substrats pourla polymérase. Par conséquent, une concentration
adéquate des ions Mg2+ est un facteur important lors de l'élongation d'ADN. Avec une concentration insuffisante
de Mg2+ peu de produit sera amplifié. Cependant, une concentration excessive de Mg2+ augmente la probabilité
de formation des produits non spécifiques. Souvent, la concentration optimale doit être déterminée de façon
empirique.Toutefois,des concentrations de 1,5 mM de MgCl2 et de 200 μM de chaque dNTP sont un bon point de
départ.
Amplification PCR-composés organique résiduels
composés organiques résiduels, tels que le phénol, le chloroforme ou l'éthanol utilisés lors de
l'extraction d'ADN, sont des inhibiteurs importants de l'activité enzymatique et devraient être éliminés par les
techniques appropriées.
Amplification PCR-Analyse résultats
l'amplification, sont mis en évidence par l'analyse d'une
aliquote de la réaction terminée sur gel d'agarose (c.-à-d. à la suite de la réaction d'amplification).
Amplification PCR-PCR en temps réel
Des techniques
de « PCR en temps réel » permettent de suivre l'amplification directement (c.-à-d. pendant la réaction
BCM328 - Projet 3 -Page 13
d'amplification). Grâce à cette dernière, la technique de la PCR est maintenant utilisée pour simultanément
amplifier et quantifier un ADN cible. Elle est même adaptée à la technique de RT-PCR pour permettre la
comparaison des niveaux d'expression de gènes. L'introduction des dosages utilisant la technique de « PCR en
temps réel » aux laboratoires cliniques de microbiologie a amélioré de façon significative le diagnostic des
maladies infectieuses.
Préparation gel d’agarose-Pk on utilise ça
pour la séparation, la purification et
l'identification des fragments d'ADN et d'ARN. C'est une technique simple et rapide pour effectuer la
séparation des fragments d'ADN.
Préparation gel d’agarose-Principe
Sous l'influence d'un courant électrique, les acides nucléiques chargés négativement en raison des
phosphates présents dans la structure de l'ADN se déplacent à travers le gel d'agarose vers la borne positive
(l'anode). Les molécules seront séparées dans le gel dû au fait qu'elles ne migrent pas toutes à la même
vitesse. Plus précisément, ces molécules sont séparées en fonction de leur taille:les plus grandes sont
retardées davantage que les plus petites qui se faufilent plus facilement dans les pores du gel. La
conformation des molécules (plus ou moins compacte) influence également la séparation des molécules
d'acides nucléiques.
Préparation gel agarose-Le taux de migration de l’ADN dépend de 4 paramètres :
- La taille moléculaire de l’ADN.
L'ADN linéaire double brin migre dans le sens de la longueur de sa molécule à une vitesse
inversement proportionnelle au logarithme de sa taille. Alors les molécules de petite taille se
faufilent plus facilement dans les pores du gel que les molécules de grande taille.
2.La concentration de l’agarose.
Un fragment d'ADN d'une taille donnée migre à des vitesses différentesselon la concentration en
agarose du gel. Il est possible de séparer un très grand nombre de fragments d'ADN de longueurs
différentes par l'électrophorèse dans des gels de concentrations différentes (Tableau VI).
- La conformation de l’ADN.
Les trois formes d'ADN plasmidique, superenroulée (surenroulée ou 《supercoiled »,forme
I),relâchée (encochée ou « nicked circular », forme II) et linéaire (forme III), migrent à des vitesses
dépendantes de la concentration d'agarose, du champ électrique, de la force ionique, des tampons
et de la densité des torsions suprahélicoïdales. - Le courant appliqué.
À bas voltage, le taux de migration d’ADN linéaire est proportionnel au voltage. Cependant,la
mobilité des fragments de grande taille monte d'une façon différentielle avec l'augmentation de la
force du champ électrique. L'efficacité de la séparation est ainsi réduite avec l'augmentation du
voltage. Le voltage maximal normalement utilisé pour un gel d'agarose se situe autour de 5 V/cm.
