Projet 1 théorie Flashcards
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- C’est une technique utilisée comme première étape dans …
l’isolement de protéines
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- C’est basé sur quoi?
La différence de solubilité des protéines dans un sel
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-la technique?
Une précipitation différentielle des protéines l’échantillon par l’accroissement progressif de la concentration d’un sel
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-Cette méthode de purification qui élimine quoi?
-Élimine certaines protéines indésirables
-Enlève des produits solubles non-voulus
-Concentre l’échantillon tout en maintenant l’activité biologique et la conformation des protéines
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- Généralités du sel
-Peu couteux
-Très solubles, même à de fortes concentrations
-Dissolution n’affecte pas la température de la solution
-Dissolution dénature pas les protéines—»conserve activité de la protéine d’intérêt
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- Ce sel induit l’agrégation et la précipitation des protéines en réduisant leur solubilité par 2 phénomènes…
-Une compétition pour les molécules d’eau disponibles en solution (déshydratation)
-Une neutralisation des résidus chargés à la surface des protéines
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-salting-in vs salting-out
Salting-in: plus la concentration de sel augmente (juste un peu), la solubilité de la protéines augmente drastiquement et à une haute concentration de sel la solubilité diminue rapidement. Il y a un plateau entre les 2
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- explique la méthode
- Ajoute lentement et graduellement sel jusqu’à une concentration qui ne cause pas la précipitation de la prot d’intérêt—» les autres prot à cette concentration sont éliminés, car ils précipitent et on centrifuge
- Le surnageant contient la prot d’intérêt et d’autre protéines solubles
3.D’autre sulfate d’ammonium est ajouté jusqu’à une concentration qui fait précipiter la protéine d’intérêt - Centrifuge et le surnageant qui reste contient des protéines indésirables solubles et on conserve le culot contenant la protéine d’intérêt
5.Dissolution de celui-ci dans un tampon faible en sel (pk peu de sel?–»car une forte concentration en sel peut se retrouver dans la solution protéique et nuire - Enlève sel de l’échantillon
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-Décrit dans quoi on retrouve l’albumine
-Sérum de bovin
-60% d’albumine et 35% de globulines
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium- décrit le BSA
583 a-a
66kDA
BSA ressemble à HSA (humaine)
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-différence entre BSA et HSA
BSA: 2 résidus tryptophane(Trp-134 et Trp-212)
HSA: 1 résidu tryptophan (Trp-214)
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-Fonction de l’albumine
-mainteint pression osmotique
-transport variété de substance comme hormone, AG et mol pharmacologiques
Isolement d’albumine par précipitation au sulfate d’ammonium-charte
Voir charte p.4 projet 1
Élimination du sulfate d’ammonium par colonne de dessalage-généralités colonne de dessalage
-Chromatographie d’exclusion
-Élimine sels de sol protéique
-Utilisation tampon pour équilibré
-Molécule sont séparés en fonction de leur taille et de leur forme
Élimination du sulfate d’ammonium par colonne de dessalage-type de colonne de dessalage utilisé en laboratoire
-Cytiva PD-10
-mol de plus de 6000Da excuse de la matrice et sont éludée en 1er= Volume mort
-Sel inclue dans le gel et eluées tardivement
-Enlève sel de l’albumine
Élimination du sulfate d’ammonium par colonne de dessalage- comment vérifier efficacité du dessalage
Avec conductimètre: mesure capacité d’un liquide à faire passer un courant électrique
La conductivité augmente selon la concentration constituants ionisés (microsiemens/cm)
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-propriété de liaison et de transport de l’albuminé selon quoi?
structure tridimensionnelle des sites de liaison de prot
Si changement de structure = nuit à liaison et transport de certains ligand—» pas d’efficacité d’un traitement et distribution
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Identification et caractérisation de l’albumine
-dizaines représentations structurales de l’albumine pour lier un Rx
-Utilisation colorants fluorescent comme ANS pour étudier la liaison de molécule à l’albumine
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Utilisation de l’ANS dans lab
1.Liaison ANS-Alb en présence ou non agent chimique qui dénature prot
2.Si AS et tétracycline peuvent déplacer ANS de complexe ANS-Alb
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Principe de la fluorescence
-émission de lumière après excitation de molécules particulières par une souche lumineuse qui lui permet d’absorber un photon
-état électronique instable
-Avant excitation, Processus de relaxation non radiatif qui va faire perdre énergie
-Pendant ce moment, energie d’Excitation est transféré par vibration ou chaleur au slv
-La molécule sera dans un état encore excité, mais de plus faible énergie qui pourra revenir dans son état fondamental pour l’émission d’un photon.
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-principe d’une MOLÉCULE FLUORESCENTE
Molécule qui absorbe énergie lumineuse à une longue d’onde donnée (LONGEUR D’ONDE D’EXCITATION) et réémettre fluo à longueur d’onde plus grande :LONGEUR D’ONDE D’ÉMISSION) selon déplacement de Stokes calcul (longueur d’onde Emission-excitation) pour savoir déplacement
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-facteur qui influe fluo d’une molécule
-polarité solution
-viscosité milieu
-T
-pH slv
-présence de solutés, comme prot
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-appareil qu’on utilise
Fluorimètre
1)source lumineuse
2)monochromateur/filtres émissions
3)compartiment pour échantillom
4)un autre monochromateur/filtre excitation
5)détecteur
6)système pour analyser signal
après avoir passer le filtre, une partie de la lumière excite certaines molécules de l’échantillon. lumière émise concentrée par filtre à 90 degré de filtre excitation et captée par détecteur
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine- ANS généralités
-Fluorescence dépends environnement
-interaction ANS-slv peut affecter paramètre fluo comme longueur d’onde émission, efficacité émission et durée émission
-ANS pas fluo en milieu polaire mais très fluo non polaire environement
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-ANS généralités avec alb
-ANS se lie région hydrophobe de prot ce qui diminue son interaction avec solvant—» -énergie dissipée et efficacité émission est plus grande
-DOnc fluo à forte intensité à longueur d’onde émission moins grande, mais d’énergie élevée (surface BSA hydrophobe exposée=forte fluo
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine- Liaison médicamenteuse selon 2 approches principales
1.Méthode de saturation
2.Méthode de déplacement
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Méthode de saturation
-Détermine affinité ligand-récepteur
-Ligand souvent marqués
-[Ligand] est augmentée en présence d’une [récepteur] constante
Voir graphique page 14
-Kd: affinité ligand à son récepteur. Que de ligand qui occupe 50% récepteurs
-Bmax:[ligand] maximal qui peut être lié=nb de liaison maximal
-nb de site de liaison (n): quantité de récepteur disponibles, en admettant qu’une molécule de ligand lie 1 site —» graphique Scatchard (la transformation de données fausse erreur expérimentale de sorte qu’elles n’obéissent pas aux hypothèse de régression linéaire. DONC SI DONNE CE GRAPH A EXAM: ON LE PREND PAS POUR DÉTERMINER KM ET BMAX
-facteurs qui influence liaison ligand-récepteur: pH,T,produits chimiques,[ion], agents chaotropiques
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Méthode de déplacement
Détermine affinité ligand pour un site de liaison. Compare plus molécule entre elles dans conditions expérimentales identiques
[ligand]marqués fixe et [ligand] croissante non-marqué (inhibiteur) et trace graphique
-IC50: [ligand non-marqué] pour déplacer 50% du ligand marqué des sites de liaisons
Étude de liaison de l’ANS à l’albumine-Analyse fluo
