Praktiske øvelser

Question 1

Beskrive de vigtigste metoder til virus påvisning

Answer 1

(dyrkning i celler og æg, antigen ELISA, SNAP test, HA test, in situ metoder (immun farvning mm), PCR og real time PCR)

Question 2

AIV avian influenza A virus staining protocol. Inokulation i mammale celler.

Answer 2

Princippet i forsøget er at påvise Avian Influenza A Virus (fugleinfluenzavirus) i mammale celler ved at inkubere cellerne med fortyndede virusprøver og efterfølgende anvende specifikke antistoffer, der gør det muligt at visualisere virusset under mikroskopet. Efter farvning og vurdering af farvningsniveauet, kan graden af virusinfektion i cellerne bestemmes.

plade, ethanol, vaskebuffer, primære antistof, inkuber i 55 min i 37 grader, vask, sekundært antistof, 25 m 37 grader, vask, alcohol, inkuber 10 min, miliQ vand - aflæs i inverted light microscope om der er rød farvning.

Question 3

⭐Sampling of dead animal

Answer 3

Princippet i dette forsøg er at påvise avian influenza-virus i en besætning ved at tage prøver fra to afdøde dyr. Da nogle stammer af avian influenza har en præference for at replikere i tarmsystemet og andre i luftvejene, udtages prøver fra både tarmsystemet (cloacal) og luftvejene (trachea). Cloacalprøven tages med en vatpind fra kloaken og placeres i en beholder mærket “Kloarkmedie”. Trachealprøven tages med en anden vatpind fra fuglens luftrør og placeres i en beholder mærket “Enkeltstyrke”. Begge prøver vil blive anvendt til PCR-testen, og resultaterne vil være tilgængelige på dag 2.

Question 4

⭐Inoculation of 8-10 day old embryonated eggs

Answer 4

Princippet i denne tekst er at demonstrere og udføre inkubation af 8-10 dage gamle embryonerede æg. Proceduren involverer identifikation af luftsækken ved hjælp af en kandellampe, markering af det sted, hvor inkubationen skal foretages, og derefter injektion af prøvemateriale eller kontrolopløsning i æggene. Efter inkubationen opnås allantoisvæske fra æggene, og der udføres en hurtig HA-test for at vurdere resultatet. For at teste steriliteten af isolatet udføres yderligere inkubation på blodagarplade. En tilsvarende procedure udføres også med brug af blæk i en praktisk øvelse. Temperaturen og procedurerne er nøje kontrolleret for at sikre pålidelige resultater og minimere forurening under inkubationsprocessen.

Virus kan vokse i æg på grund af æggets næringsstoffer, beskyttende miljø, optimal inokulationssite, tilstedeværelse af embryonisk væv og brugen af ægget som et praktisk forsøgssystem.

Question 5

Tile-test

Answer 5

Princippet i dette forsøg er at teste to forskellige avian influenza-virus (Høne 1 og Høne 2) ved at blande dem med kyllingblod på en flise. Der anvendes også en negativ kontrol, hvor blodet blandes med PBS (phosphate-buffered saline) i stedet for virus. Resultaterne aflæses ved at vippe flisen og observere, om blodet har præcipiteret inden for 1 minut. Dette testsetup giver mulighed for at vurdere, hvordan de to vira reagerer med kyllingblodet og at identificere eventuelle præcipitationsreaktioner som en indikation af virusaktivitet.

Question 6

HA – Haemagglutination test

Answer 6

Princippet i dette forsøg er at anvende en hæmagglutinationstest til at kvantificere den relative mængde af visse vira, herunder influenzavirus, paramyxovirus, poxvirus, adenovirus, parainfluenzavirus, parvovirus, enterovirus og togavirus, der er i en virus suspension. Testen indebærer to-fold fortyndelser af den virale suspension i en mikrotiterplade, efterfulgt af vurdering af en endepunkt. Resultatet bruges til at bestemme mængden af hæmagglutinin i suspensionen og angives som en HA-titer.

HA negativ: En skarp knap af røde blodlegemer i bunden af V-bundbrønden, som løber med samme hastighed som kontrolbrøndene.
.
HA positiv: En sløret film af røde blodlegemer, ingen knap eller en meget lille knap af røde blodlegemer i bunden af V-bundbrønden, som ikke løber, når pladen tipper.

Question 7

HI – Haemagglutination inhibition test

Answer 7

HI-testen (Haemagglutination Inhibition) måler immunresponsen på haemagglutinin-proteinet i f.eks. influenza-virusets membran. Når serum indeholdende virus-specifikke antistoffer blandes med virus, binder antistofferne til haemagglutinin-proteinet. Dette blokerer for, at haemagglutinin-proteinet binder til erythrocytter (røde blodlegemer), hvilket hæmmer haemagglutinationen mellem virus og røde blodlegemer. To-fold fortyndelser udføres på serum før testen for at udtrykke antistofkoncentrationen som en HI-titer. Ved brug af kendt specifikt antiserum i HI-testen kan HA-underarten af en ukendt virusisolat bestemmes.

Question 8

Forskel på HI og HA test

Answer 8

HI-testen fokuserer på at påvise specifikke antistoffer i serum, mens HA-testen fokuserer på at måle virusets evne til at agglutinere røde blodlegemer.

HA-test (Haemagglutination):
Måler virusens evne til at agglutinere (klumpe sammen) røde blodlegemer.
Bruger to-fold fortyndelser af den virale suspension.
Resultatet angives som en HA-titer.
Bestemmer mængden af hæmagglutinin i suspensionen.

HI-test (Haemagglutination Inhibition):
Måler inhiberingen af haemagglutination ved tilstedeværelsen af specifikke antistoffer.
Bruger to-fold fortyndelser af serum.
Resultatet angives som en HI-titer.
Bestemmer H-typen (H1, H5, H7 eller H9) ved brug af kendt antiserum.
Bruger røde blodlegemer til at vise inhibering af haemagglutination (knappen).

Question 9

Cellekultur titration af virus - teori

Answer 9

De fleste vira kan dyrkes i cellekulturer, især når den rette celletype anvendes. Primære cellekulturer, skabt ved at skære væv i små stykker og behandle det med EDTA og trypsin, bruges ofte til diagnostiske formål. Vedligeholdelse af celler kræver regelmæssig mediumskift og passagering.

Cellekulturer er afgørende i virologisk forskning. Fibroblaster er vigtige for komplekse organer som nyrer. Eksisterende cellelinjer kan købes. Celler vedligeholdes ved ugentligt mediumskift og trypsination. De kan fryses ved minus 80 grader i måneder/år.

En celletype er modtagelig for en virus, hvis virusset kan formere sig i cellen. Viruset hæfter på cellemembranen via en ligand-receptorbinding. Efter vedhæftning trænger virusset ind i cellen og aktiverer transkriptions- og DNA/RNA-formeringssystemet. RNA-virusser producerer afkom-RNA direkte. Virioner syntetiserer genetisk materiale og proteiner til capsiden og nogle gange en membran.

Question 10

⭐Determination of virus titre

Answer 10

Styrken af et virusisolat determineres af titration. Styrken måles af den højeste fortyndingsfaktor af virusisolat som stadig inficerer celle kultur.
Kaldes END-POINT-TITRATION.
Ti foldsfortunding, inokulering på cellekultur i mikrotitre bakke.

Efter inkubation læses celler for cytopatisk effect CPE. eller fixkeres og staines med mespecikke antistoffer til at detektere virus.

Question 11

Virus genom

Answer 11

virus har genetisk materiale enten i form af DNA eller RNA, aldrig begge dele samtidig. Der er både enkeltstrengete og dobbeltstrengete virus af både DNA og RNA. Nogle virus skal medbringe genetisk information for at producere specifikke enzymer. RNA-virus, som retrovirus, kræver en RNA-afhængig DNA-polymerase for formering. PCR kan detektere RNA-virus ved brug af reverse transcriptase.

Eksempler inkluderer ds-DNA-virus som Asfiviridae eller Poxviridae, ss-DNA-virus som Parvoviridae, eller cirkulerende ss-DNA-virus som Circoviridae. Mange virus har RNA som genetisk materiale. Nogle har en RNA-afhængig RNA-polymerase, mens andre, som retrovirus, kræver en RNA-afhængig DNA-polymerase.

RNA-virus kan være positive eller negative strenge. Positiv streng fungerer som budbringer-RNA og går direkte til ribosomerne for oversættelse til protein. Negative streng kræver enzymer for omdannelse fra ssRNA til dsRNA. Det er vigtigt at undgå RNAser ved håndtering af RNA-virus, da de er følsomme overfor nedbrydning. In situ hybridisering kan skelne mellem virus i virioner og virusnukleinsyrer i formeringsprocessen.

Question 12

Princippet i PCR

Answer 12

Opformering af virus
DNA, DNA polymerase, L og R primerere, dNTP’er (4 forskellige)

Denaturering (95) bryder hydrogenbind.
Annealing (55-65) primere
syntetisering (72) DNA polymerase, nukleotider, byggesten i 5-3 retning. 30 cyklus = 1 cyklus fordopler DNA mængde eksponentielt.

Question 13

Princippet i genotyping

Answer 13

genotyping bestemmer persons genom og involverer teknikker som PCR, sekventering og SNP-genotyping

Question 14

Reverse transcription

Answer 14

As PCR only works on DNA, the genomes of RNA-viruses has to be converted into DNA. This is
done by performing a reverse transcription of the genome using a specific enzyme, the reverse
transcriptase, prior to the PCR. This enzyme will extend a DNA primer annealing to RNA and
produce cDNA which is usable for PCR. This can be done seamlessly in the same tube. This is called
one-step reverse transcription PCR (RT-PCR). One of the primers used for the PCR reaction is most
often also used for priming the reverse transcription.

Question 15

Real time PCR

Answer 15

Kvantitativ PCR, mængde vir, flouricenrene stof, spectrometer, PCR cykler.
Flourescens binder kun til dsDNA og lyser ved iinding - computer - floruescens ved cyklus - CT værdi.

Question 16

Virus isolation in embryonated chicken eggs - Theory

Answer 16

Aviær influenza-virus formeres i celler langs allantoishulen, hvorfra det høstes. Inokulation sker gennem et hul i ægget, og embryoets vitalitet kontrolleres ved candling. Efter 6 dages inkubation køles æggene, embryoet dræbes, og allantoisvæsken høstes. Virusaktivitet testes ved at blande isolatet med blod på en flise. Hvis agglutination opstår inden for to minutter, betragtes prøven som positiv. En anbefalet test er hæmagglutination i en mikrotiterplade i 30-40 minutter.

Question 17

ELISA

Answer 17

ELISA test bestemmer forekomst af specifikke antistoffer i blod. ELISA er heterogen immunoassays (reaktanter er i to faser; fast fase).

Via passiv adsorption fastholdes proteiner og immobiliseres på overfladen af plastik. Adsorption kan fremmes ved specifikke koncentrationer og buffere med ph 8-10. Primær interaktion skyldes ladningsforhold og bidning med hydrofobe kræfter.
OBS: nogle antigener/stoffer denatureres under adsorptionen.
Visualisering af ELISA via enzymkonjugeret antistof med substrat der flourisere/skifter farve ved enzymatisk reaktion og tilstedeværelse af antistof. Måles i spektrofotometer.

Question 18

Direkte el indirekte, sandwich el konkurrence ELISA

Answer 18

Indirekte ELISA: Identificerer antistoffer i en prøve ved at måle, hvor godt de binder sig til et kendt antigen.
Direkte ELISA: Detekterer selve antigenet i prøven ved at måle bindingen til et specifikt antistof.
Sandwich ELISA: Bruger to antistoffer, hvor det ene binder sig til antigenet i prøven, mens det andet fanger det mellem sig, hvilket muliggør påvisning af antigenet.
Konkurrence ELISA: Anvendes til at konkurrere om binding til et fastlagt antigen mellem prøven og et mærket antistof for at bestemme mængden af antigen i prøven.

Question 19

Beskriv ud fra figur 4, hvordan det antistofbaserede assay er opbygget, herunder:

Hvad er bundet (immobiliseret) til strippen?

Hvad er analytten? (det der måles)?

Hvordan fremkommer den blå farve?

Hvorfor bliver kontrollen altid farvet

Hvorfor er det vigtigt, at det er den nederste del af strippen og ikke der, hvor stregerne er, der vædes med urinprøven?
Hvad er fordelen ved denne type immuntest i forhold til fx ELISA?

Answer 19

Beskriv ud fra figur 4, hvordan det antistofbaserede assay er opbygget, herunder:
sandwich assay når to antisotffer binder til to binding sites på analytten.
Hvad er bundet (immobiliseret) til strippen? Specifikke antistoffer komplimentære til HCG hormonet der udskilles tidligt i graviditeten
Hvad er analytten? (det der måles)? Tilstedeværelse af HCG (og deraf graviditet).
Hvordan fremkommer den blå farve?
Udover sandwich antistoffer er også substrat som enzym på sekundært antistof spalter når det når til testfeltet.
Hvorfor bliver kontrollen altid farvet
De øvrige immunkomplekser og frie sekundære antistoffer vil bevæge sig videre og bindes længere fremme i et kontrolfelt, hvortil der er fastgjort et antistof mod det sekundære antistof. De sekundæer antistoffer opkoncentreres og bindes alle til et tertiørt antistof på den positive kontrol.

Positiv kontrol har anti-antistoffer der specifikke til de primære antistoffer mærket med farve.

Hvorfor er det vigtigt, at det er den nederste del af strippen og ikke der, hvor stregerne er, der vædes med urinprøven?
Det er vigtigt, at kontrolområdet (normalt nederste del af strippen) altid får kontakt med urinprøven for at validere testen. Hvis kontrolinjen ikke farves, kan det indikere en fejlagtig testprocedure eller en ugyldig test.
Sekundære antistoffer kan kun komme op i kontrol og test hvis urinen trækkes op langs fasen.

Hvad er fordelen ved denne type immuntest i forhold til fx ELISA?
Hurtig, ikek behov for laboratorie, forholdsvis sikker
Hvad er begrænsningerne ved denne type immuntest i forhold til fx ELISA?
Virker ikek op hopper, mere sikker?

Question 20

Oprensning af leukocytter fra blod

Answer 20

Antallet af Leukocytter i blodet udgør kun ca. 1 promille af det totale antal celler, og det er derfor
nødvendigt at oprense leukocytterne, hvis man ønsker at analysere på dem. I denne øvelse skal vi oprense
leukocytter på to af de mest almindelige brugte metoder (RBC-Lysis metoden og Densitets-gradient
oprensning).
Densitets-gradient oprensning er baseret på adskillelse af blodcellerne efter størrelse og masse vha. centrifugering i en densitets-gradient opløsning. Gradienten i opløsningen bestemmer, hvilke celler man oprenser/ender ud med. I dette forsøg bruger vi Histopaque-1.077, hvorved vi ender med en cellesuspension bestående af lymfocytter og monocytter.
RBC lysis metoden er mere simpel og baseret på lysering af de røde blod celler, hvorved man kun fjerner de røde blodceller fra blodet. Efter oprensning analyserer vi leukocytterne på et flow cytometer (FACS). Herved kan vi differentiere mellem de forskellige leukocytpopulationer, baseret på cellernes størrelse og granulering. Dette gøres i et forward-/side-scatter plot.

Question 21

RBC-Lysis metoden:

Answer 21

Tag 500 μL fortyndet blod (udleveres af underviseren, fortyndet 1:3 i PBS) over i et 15 mL falcon rør.
HUSK at skrive holdnr. på røret.
Tilsæt 2ml RBC lysis opløsning (2x1000 μl med 1000ul pipette og blå spids). Vend forsigtigt røret et par gange for at blande opløsningen.
Kig på opløsningen og bemærk, at den går fra at være uklar til at blive gennemsigtig (tegn på hæmolyse). Cellerne må MAX stå i 10 min, ellers dør alle cellerne.
Fyld røret (gøres ved at hælde) op til 14 ml mærket med PBS (for at vaske cellerne).
Centrifugér prøven 5 min ved 300 x g. Bemærk efter centrifugering, at cellepellet nu er mindre og ikke nær så rød.
Hæld supernatanten ud i røret til affald i én bevægelse, og genopløs cellepellet i bunden af røret i 1(0,5!) ml PBS.
Overfør celleopløsningen til et eppendorf rør, mærk røret RBC.
Placer eppendorf røret med cellerne på is (gul spand).
Cellerne er nu oprenset og klar til videre analyse ved flowcytometri.
NOTE: Begge prøver analyseres samlet til sidst.

Question 22

B. Densitets-gradient oprensning

Answer 22

VIGTIGT: start først på denne metode, når alle hold er klar.
Tag et rør med 2 ml Histopaque og et rør med 2 ml fortyndet blod.
Læg ganske forsigtigt de 2 ml fortyndet blod oven på de 2 ml histopaque (fyld op til 4 mL i røretmærket med histopaque). Hold røret med histopaque lidt på skrå, placer pipettespidsen lidt over væskeoverfladen og lad blodet løbe ned af siden af røret. Det er vigtigt at blod og Histopaque ikke blandes, ellers vil oprensningen ikke lykkes.
Sæt låg på røret og placer det forsigtigt i centrifugen.
Prøven centrifugeres 20 min ved 400 x g uden bremse (tager ca. 25 minutter i alt). Alle spinner samlet!
Efter centrifugering vil du kunne se et mælkehvidt tyndt lag imellem de to væske faser.
Fjern nu forsigtig det hvide lag: Tryk luften ud af pipettespidsen, før denne ned i væsken med spidsen lige over det hvide lag og sug forsigtig laget op. Før forsigtigt spidsen jævnt over det hvide lag for af at ’støvsuge’ alle cellerne op.
Cellerne i det hvide lag overføres til et nyt 15 ml falcon rør.
Fyld røret (gøres ved at hælde) op til 14 ml mærket med PBS (for at vaske cellerne).
Centrifuger prøven 5 min ved 300 x g.
Hæld supernatanten ud i røret til affald og genopløs cellepellet i bunden af røret i 1 ml PBS.
Overfør celleopløsningen til et eppendorf rør, mærk røret DGO.
Placer eppendorf røret med cellerne på is.
Cellerne er nu oprenset og klar til videre analyse ved flowcytometri.

Question 23

C. FACS analyse:

Answer 23

FACS analysen vil finde sted i en anden bygning (Ridebanevej 9, rum nr 62-0-217). Her vil jeres undervisere gennemgå analysen, som I derefter tager med tilbage til en fælles gennemgang. NOTE: Der er KUN plads til 2 hold af gangen ved Flowcytometeret. Derfor sendes 2 hold af sted første gang og når et hold går tilbage, sender de det næste af sted.

Spørgsmål:
Hvad er forskellen på de to oprensningsmetoder?
Hvad er forskellen på udbyttet?
I densitetsoprensning kommer kun monocytter og lymfocytter - granulocytterne mister vi da de fjernes i sortering mellem mono- og polynukleære celler.
I RBC lysis metode sorteres der ikke mellem mono- og polynukleære celler. Der sker således kune n adkillelse af rbc og leukocytterne
OBS i flowcytometri kan mængden af X måles ved at tilsætte farvet antistof komplementær til eks TCR på t celler eller BCR eller hvad end man nu leder efter.

Sidescatter - cellegranulering
forward scatter - cellestørrelse