PCR y FISH

Question 1

Historia

Answer 1

• 1985: Karry B. Mullis

* Publica artículo de PCR para amplificar DNA

Question 2

¿Por qué amplificar?

Answer 2

Para estudiar genes necesitar muchas copias de DNA.

- El gen representa una fracción MUY PEQUEÑA del DNA celular total

Question 3

PCR

Answer 3

• Amplifica billones de veces cantidades muy pequeñas de DNA (incluso 1 molécula) en unas horas.

Question 4

Reactivos para PCR

Answer 4

1. Templado de DNA
2. Cebadores 5 y 3 (sentido y anti-sentido)
3. Taq polimerasa (70ºC)
4. desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP)
5. Solucción buffer
6. Mg+

Question 5

1. PCR

Answer 5

1. Calentar DNA (90-100º)

- Desnaturalizar –> romper H-bonds y separar la doble hélice 1-2 min

Question 6

2. PCR

Answer 6

2. Enfriar solución (30-65º) x 1 min

- Evita renaturalización para que los primers se unan al templado

Question 7

3. PCR

Answer 7

3. Calentar solución (60-70º) x 1 min
   - Para que la DNA polimerasa pueda sintetizar
   RESULTADO: 1 molécula = 2 DNA

Question 8

RESULTADO PCR

Answer 8

DNA target aumenta geometricamente
10 ciclos: amplifica 1000 veces
20: “” 1 millón
30: “” 1 billón

Question 9

Aplicaciones DNA

Answer 9

Detectar presencia de una secuencia de DNA
Ejemplo: virus de SIDA
- Detecta la presencia y cuantifica el nivel de infección del patógeno

Question 10

Otros usos PCR

Answer 10

1. Genotipeo
2. Detectar RFLP’s (polimorfismos de longitud de fragmento de restricción) –> diagnósitco
3. Identificar polimorfismos de satétiles (STR’s) —> huella molecular (genética forense, clonación de genes y mapas genéticos)
4. NGS

Question 11

Ciencia forense

Answer 11

• Uso de fluorocromos diferentes para identificar hasta 10 marcadores microsatélites (VNTR) en un gel automatizado “multiplex”

Question 12

Usos extra de PCR

Answer 12

Molecular: diagnóstico prenatal, epidemiología, screening para mutaciones, detección de patógenos
Secuenciamiento: HGP

Question 13

PCR insitu

Answer 13

Hacer PCR en preparación fija (tejido/célula) –> observas productos en el sitio de amplificación

Question 14

PCR múltiplex

Answer 14

Amplificar + de 1 secuencia en una reacción

Question 15

RT-PCR

Answer 15

Usar transcriptasa reversa y un molde de mRNA –> síntesis de DNA complementario

Question 16

qPCR (en tiempo real/cuantitativa)

Answer 16

Cuantificar cantidad de DNA/RNA de una muestra

Question 17

FISH

Answer 17

Hibridación insitu usando fluorescencia

Question 18

FISH - OVERVIEW

Answer 18

• Hibridizar sondas marcadas con un fluorocromo a una prepración de cromosomas en una laminilla y ves su posición con un micro epifluorescente
• Se una para mapeo físico de genes humanos

Question 19

Hibridación

Answer 19

1. Marcar sondas con fluorocromo
2. Desnaturalizar sonda y DNA cromosomal
3. Hibridizar sondas marcadas con f. a preparaciones de cromosomas en laminillas

Question 20

Detección del signo

Answer 20

1. Lavas para quitar exceso de sondas y fluorocromos
2. Tiñes cromosomas para contrasten con el signo de la sonda
3. Usas micro epifluorescentes para ver localización

Question 21

Micro epifluorescente

Answer 21

Propiedad de algunos materiales de emitir energía en forma de luz visible (LUZ DE EMISIÓN: onda larga) cuando son irradiados con luz de excitación (onda corta)
- La muesta brilla si est{a tratada con fluorocromo, clorofila, minerales

Question 22

Qué requiere el fluorocromo FITC (fluorescin isothiocyanate)

Answer 22

Luz de excitación y de emisión

Question 23

Primer filtro

Answer 23

Sólo deja pasar a la luz con la longitud de onda necesaria para excitar al fluorocromo

Question 24

Espejo (filtro) dicroico

Answer 24

Refleja la luz menor a 510 nm y deja pasar la luz mayor de 510 nm

Question 25

Segundo filtro (FITC)

Answer 25

Elimina signos de fluorescencia innecesarios y sólo deja pasar ondas de 520-560 nm (signo verde)

Question 26

Identificación de cromosomas humanos con FISH

Answer 26

“Chromosome painting”

• Metafase
• Identificar c/cromosoma y regiones específicas dentro de ellos

Question 27

Identificación de brazos del cromosoma - FISH

Answer 27

• Necesitas identificar al mismo tiempo 2 sondas ==> marcar 2 sondas con fluorocromos dif. e hidridizarlas
• Sondas teloméricas ==> asignas sondas a brazos de cromosomas específicos

Question 28

Identificación de genes activos y sus productos génicos - FISH

Answer 28

• Identificar mRNA específico en ciertos rejidos
• Identificar proteínas específicas usando anticuerpos marcados con fluorocromo para hacer mediciones cuantitativas de la proteína o diagnosticar su ausencia

Question 29

Factor VII

Answer 29

Detección de mRNAs de VIII con sondas marcadas con FITC

Question 30

Erb2

Answer 30

Detección de Erb2 en c. cancerosas con anticuerpos marcados con Cy3

Question 31

CML

Answer 31

• Cromosoma Filadelfia (BCR-ABL): translocación recíproca t(9;22) (q34;q11)
• FISH 95% efectivo
• Signos rojos: 9q34
• Signos verdes: 22q11
• Signos rojos y verdes: marcan banda 9q34 traslocada a 22q11

Question 32

Deleción en cromosoma 22

Answer 32

En un cromosoma 22 hay signos rojos y verdes

En otro cromosoma 22 sólo hay verdes = DELECIÓN INTERSTICIAL entre centrómeto y telómero del cromosoma

Question 33

Síndrome de Smith Magelis: deleción en cromosoma 17

Answer 33

• Signo verde: identificar q
• Signo rojo: identificar p
• SMS: signo rojo ausente = deleción 17p11.2
• Puedes teñir muestra con ioduro de propidio (rojo)

Question 34

Leucemia Linfoblástica Aguda

Answer 34

Cariotipo normal: 4 (rojos), 11 (verdes)
Cariotipo ALL: 4 (rojos), 11 (verdes), translocado (ambos)
*Translocación t (4;11) (q21-q23)

Question 35

Trisomía 21

Answer 35

• Núcleo en interfase3

- 3 signos rojos en crom 21

Question 36

Mapeo físico del gen de distrofina (Duchenne)

Answer 36

• Cromosoma 9: gen de distrofina (signos rojos)
• Usas sonda con una parte de la secuencia del fen distrofina (DMRT2)
• Signos verdes FITC –> sonda centromérica para identificar cromosomas 9
• Tinción de cromosomas: DAPI (azul)

Question 37

Amplificación de proto-oncogen HER-2/neu

Answer 37

• 20-30 % cáncer de mama

- Interfase o metafase: signos rojos –> amplificación de HER-2/neu