PCR y FISH Flashcards
Historia
- 1985: Karry B. Mullis
* Publica artículo de PCR para amplificar DNA
¿Por qué amplificar?
Para estudiar genes necesitar muchas copias de DNA.
- El gen representa una fracción MUY PEQUEÑA del DNA celular total
PCR
- Amplifica billones de veces cantidades muy pequeñas de DNA (incluso 1 molécula) en unas horas.
Reactivos para PCR
- Templado de DNA
- Cebadores 5
y 3(sentido y anti-sentido) - Taq polimerasa (70ºC)
- desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP)
- Solucción buffer
- Mg+
- PCR
- Calentar DNA (90-100º)
- Desnaturalizar –> romper H-bonds y separar la doble hélice 1-2 min
- PCR
- Enfriar solución (30-65º) x 1 min
- Evita renaturalización para que los primers se unan al templado
- PCR
- Calentar solución (60-70º) x 1 min
- Para que la DNA polimerasa pueda sintetizar
RESULTADO: 1 molécula = 2 DNA
RESULTADO PCR
DNA target aumenta geometricamente
10 ciclos: amplifica 1000 veces
20: “” 1 millón
30: “” 1 billón
Aplicaciones DNA
Detectar presencia de una secuencia de DNA
Ejemplo: virus de SIDA
- Detecta la presencia y cuantifica el nivel de infección del patógeno
Otros usos PCR
- Genotipeo
- Detectar RFLP’s (polimorfismos de longitud de fragmento de restricción) –> diagnósitco
- Identificar polimorfismos de satétiles (STR’s) —> huella molecular (genética forense, clonación de genes y mapas genéticos)
- NGS
Ciencia forense
- Uso de fluorocromos diferentes para identificar hasta 10 marcadores microsatélites (VNTR) en un gel automatizado “multiplex”
Usos extra de PCR
Molecular: diagnóstico prenatal, epidemiología, screening para mutaciones, detección de patógenos
Secuenciamiento: HGP
PCR insitu
Hacer PCR en preparación fija (tejido/célula) –> observas productos en el sitio de amplificación
PCR múltiplex
Amplificar + de 1 secuencia en una reacción
RT-PCR
Usar transcriptasa reversa y un molde de mRNA –> síntesis de DNA complementario
qPCR (en tiempo real/cuantitativa)
Cuantificar cantidad de DNA/RNA de una muestra
FISH
Hibridación insitu usando fluorescencia
FISH - OVERVIEW
- Hibridizar sondas marcadas con un fluorocromo a una prepración de cromosomas en una laminilla y ves su posición con un micro epifluorescente
- Se una para mapeo físico de genes humanos
Hibridación
- Marcar sondas con fluorocromo
- Desnaturalizar sonda y DNA cromosomal
- Hibridizar sondas marcadas con f. a preparaciones de cromosomas en laminillas
Detección del signo
- Lavas para quitar exceso de sondas y fluorocromos
- Tiñes cromosomas para contrasten con el signo de la sonda
- Usas micro epifluorescentes para ver localización
Micro epifluorescente
Propiedad de algunos materiales de emitir energía en forma de luz visible (LUZ DE EMISIÓN: onda larga) cuando son irradiados con luz de excitación (onda corta)
- La muesta brilla si est{a tratada con fluorocromo, clorofila, minerales
Qué requiere el fluorocromo FITC (fluorescin isothiocyanate)
Luz de excitación y de emisión
Primer filtro
Sólo deja pasar a la luz con la longitud de onda necesaria para excitar al fluorocromo
Espejo (filtro) dicroico
Refleja la luz menor a 510 nm y deja pasar la luz mayor de 510 nm
Segundo filtro (FITC)
Elimina signos de fluorescencia innecesarios y sólo deja pasar ondas de 520-560 nm (signo verde)
Identificación de cromosomas humanos con FISH
“Chromosome painting”
- Metafase
- Identificar c/cromosoma y regiones específicas dentro de ellos
Identificación de brazos del cromosoma - FISH
- Necesitas identificar al mismo tiempo 2 sondas ==> marcar 2 sondas con fluorocromos dif. e hidridizarlas
- Sondas teloméricas ==> asignas sondas a brazos de cromosomas específicos
Identificación de genes activos y sus productos génicos - FISH
- Identificar mRNA específico en ciertos rejidos
- Identificar proteínas específicas usando anticuerpos marcados con fluorocromo para hacer mediciones cuantitativas de la proteína o diagnosticar su ausencia
Factor VII
Detección de mRNAs de VIII con sondas marcadas con FITC
Erb2
Detección de Erb2 en c. cancerosas con anticuerpos marcados con Cy3
CML
- Cromosoma Filadelfia (BCR-ABL): translocación recíproca t(9;22) (q34;q11)
- FISH 95% efectivo
- Signos rojos: 9q34
- Signos verdes: 22q11
- Signos rojos y verdes: marcan banda 9q34 traslocada a 22q11
Deleción en cromosoma 22
En un cromosoma 22 hay signos rojos y verdes
En otro cromosoma 22 sólo hay verdes = DELECIÓN INTERSTICIAL entre centrómeto y telómero del cromosoma
Síndrome de Smith Magelis: deleción en cromosoma 17
- Signo verde: identificar q
- Signo rojo: identificar p
- SMS: signo rojo ausente = deleción 17p11.2
- Puedes teñir muestra con ioduro de propidio (rojo)
Leucemia Linfoblástica Aguda
Cariotipo normal: 4 (rojos), 11 (verdes)
Cariotipo ALL: 4 (rojos), 11 (verdes), translocado (ambos)
*Translocación t (4;11) (q21-q23)
Trisomía 21
- Núcleo en interfase3
- 3 signos rojos en crom 21
Mapeo físico del gen de distrofina (Duchenne)
- Cromosoma 9: gen de distrofina (signos rojos)
- Usas sonda con una parte de la secuencia del fen distrofina (DMRT2)
- Signos verdes FITC –> sonda centromérica para identificar cromosomas 9
- Tinción de cromosomas: DAPI (azul)
Amplificación de proto-oncogen HER-2/neu
- 20-30 % cáncer de mama
- Interfase o metafase: signos rojos –> amplificación de HER-2/neu
