Illumina sequence - NGS platforms

Question 1

NGS

Answer 1

• Secuenciación rápida y a gran escala de NGS de Ilumina

- Caracterización de genomas complejos

Question 2

Secuenciación de ácidos nucleicos

Answer 2

• Determinar el orden exacto de nucleótidos en una molécula de DNA o RNA (RNA —cDNA)

Question 3

HGP (2003)

Answer 3

• Primera secuenciación a gran escala

- Técnicas de primera generación: Secuenciación Sanger (di-dioxy) *1975

Question 4

NGS

Answer 4

• Menos $$ vs primera generación
• Secuenciación masiva de fragmentos de DNA organizados de manera paralela
• Las plataformas NGS permiten secuenciación a gran escala

Question 5

¿Qué hace el NGS?

Answer 5

• Menos $$ y más rápido
• Identificar genes y elementos reguladores asociados con enfermedad
• Identificar mutaciones causantes de enfermedad para diagnóstico de patologías
• RNA-seq ==> info del transcriptoma de una muestra sin saber la secuencia genética del organismo = alternativa para los microarrays en estudios de expresión genética

Question 6

Limitación NGS

Answer 6

• Errores de secuenciación en regiones homopolimèricas (microsatélites)
• Difícil análisis de datos

Question 7

Plataformas HGS

Answer 7

• Versiones de Illumina: HiSeq (1000, 1500, 2000, 2500), NextSeq 500 Desktop Sequencer, Torrent-PGM, Rocher 454 - Titanium Flex
• Diferentes grados de sofisticación de análisis

Question 8

HiSeq 2500

Answer 8

• Secuenciación por tecnología de síntesis –> secuenciación masiva paralela
• Terminadores fluorescentes
  ===> detección de bases conforme se incorporan en la hebra de DNA sintetizada
• Análisis de transcriptomas, recuperación de sRNA, perfiles de metilación y análisis de interacción de genoma y proteína-ácido nucleico

Question 9

1. Preparación de librería

Answer 9

1. Extracción de DNA de alto molecular
2. Produces fragmentos (sonificación)
3. Ligas los adaptadores (secuencias para amplificación con PCR y secuencias compatibles con oligos del Flow Cell)
4. Linearizas fragmentos de DNA

Question 10

Flow cell

Answer 10

Soporte rígido al que se unen covalentemente oligos (lawn of primers) complementarios a los índices de los adaptadores de los fragmentos del DNA que se va a secuenciar

Question 11

2. Amplifiación masiva paralela por síntesis de DNA

Answer 11

• Hibridizar el fragmento de DNA al cultivo de oligos del flow cell
• Amplificación de fragmentos por síntesis de DNA

Question 12

Formación de puentes y clusters

Answer 12

1. Las cadenas sencillas se doblan y se hibridizan a primers adyacentes para formar un puente
2. El híbrido es extendido por polimerasas
3. Desnaturalización de doble cadena de DNA
4. Lavas el templado de DNA
5. La cadena recién sitetizada está unida al flow cell (Caderna forward)
   *El proceso se repite hasta que el templado se amplifica y forma clusters del mismo fragmento de DNA
   *Puedes secuenciar cadena foward y/o reverse
   RESULTADO: más de 150 millones de clusters/flowcell y más de 100 copias en cada cluster

Question 13

3. Secuenciación por Illumina/Solexa

Answer 13

• Secuenciación por síntesis
• Se une el primer secuenciador + 4 dNTP’s (tinta dif) con un terminador reversible marcado con fluorocromo
• Eliminas el terminador al crear OH libre para agregar el siguiente nucleótido
• Señal de fluorocromo específica de los nucleótidos ==> determinar secuencia del templado del DNA