PCR/DNA Sequenzierung

Question 1

Polymerasekettenreaktion

Answer 1

•Vervielfältigung von Stück DNA

Zutaten:
•nukleotide und DNA-Fragment und hitzestabile polymerase(Verdoppelung der DNA) und Primer als startmolekule für polymerase und pufferlosung für Stabilität des pH-Wertes (magnesiumionen)

1. denaturierung
   •erhitzen 90-95* grad (20-30 sec)->doppelstrange trennen sich da WSBB zerbrechen (2 getrennte DNA strange l)
2. Hybridisierung
   •schnelles abkühlen auf 50-60 grad (damit strange nicht wieder zusammen)
   •primer lagern sich an (gegenläufige orientierte primer damit an beiden Strängen anlagern können)

3.polymerisierung (elongation)
•DNA polymerase setzt an primer an und wandert in 5‘ Richtung und verbindet nukleotide um komplementäre strange zu bilden
•erhitzen auf 70-75 grad (30 sec für 500 Paare)

-> nach ersten Zyklus zwei Exemplare des DNA Stückchens/nach 2. Zyklus vier Exemplare etc.
(Exponentiell)-> genetische fingerabdruck

•1993 Chemie Nobelpreis für kary Banks mullis

Question 2

DNA DNA Hybridisierung

Answer 2

•je größer die komplementäre Übereinstimmung desto näher die Verwandtschaft
•Feststellung durch Schmelzpunkt der DNA: erhitzen auf 70* grad besteht denaturierung und während der Abkühlung renaturieren die strange(zurück zusammen)
•Vermischung der DNA zweier Lebewesen und denaturiert und renaturieren entstehen zwei doppelstrange die aus zwei Einzelstrange der zwei Arten besteht(Hybrid DNA)
—> Verwandtschaft festgestellt durch erneutes erhitzen, denn geringer die Verwandtschaft desto geringer die WSBB die gebildet wurden
-> Ähnlichkeit der Genome aber keine Ähnlichkeit der nukleotidsequenz

Beispiel: Einordnung des Pandas - erst Kleinbär(herbivor) aber doch Großbär(Analogie zu kleiner Panda da Ähnlichkeit durch Umwelt bedingt ist)

A-T (zwei)
C-G (1)

Question 3

Gel-Elektrophorese

Answer 3

•Kriminologie->DNA eines Verdächtigen am Tatort vergleichen

Aufbau:
•agarosegel in pufferlosung (Wackelpudding)- relativ großporig und gut für auftrennend der DNA und Proteinmolekule
Gele wirken wie ein Sieb
•Kabel erzeugen elektrisches Feld: vorne positive Anode -hinten negative Kathode
•DNA in kleine Taschen auf der Seite der Kathode angebracht —> elektrische Feld bring Teilchen in Bewegung: DNA negativ geladen und wandert durch das gel in Richtung Anode
•je nach Größe und Ladung wandern die Teilchen unterschiedlich weit: DNA und RNA werden eingefärbt damit bei UV Licht betrachtet wird
•jede Bande enthält Teilchen mit gleicher Größe und Ladung
•man fügt Marker hinzu um die lange und Ladung zu vergleichen: Referenz
•erkennen von Tandemwiederholungen: wdh von nukleotiden (vntr-Region die bei jedem
Mensch anders ist werden von verdächtigen genommen und verglichen)

Question 4

DNA-Sequenzierung (nach Sänger)

Answer 4

•Bestimmung der basenabfolge in DNA Molekülen

Kettenabbruchbmethode: Reihenfolge der nukleotidbasen

• zu bestimmende DNA als Einzelstrang
• DNA polymerase
• radioaktiv markierter primer
• 4 desoxynuclrotid triphosphate
• 4 verschiedene Abbruchnukleotide (nach deren Einbau können keine nukleotide mehr binden)

Funktionsprinzip:
1. Helix in einzelstrange
2.•primer lagert sich an eingelstrang an und bildet kurzes Stück doppelstrang
•DNA polymerase verlängert den fehlenden der beiden komplementären DNA strange
3. einer der vier basen wird zum Teil als ddNtP zugegeben (haben keine 3‘ hydroxylgruppe die für die Verknüpfung notwendig ist)—>kettenabbruch
•DNA Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen und enden mit ddntp (primer oder ddntp radioaktiv markiert)

Gel-elektophorese:
Kleine Fragmente Fliesen weiter durchs gel

Basen können abgelesen werden- aber nicht codogener Strang daher noch komplementäre basen ansetzen!!!