PCR Flashcards
PRINCIPIOS BÁSICOS
Complementariedad
Dirección 5>3 (requiere que el extremo 3 este libre)
Consta de 3 estapas
Desnaturalización
Replicacion
Elongación
Componentes
ADN
PRIMERS
DNA POLIMERASA
DNTPS-> desoxinucleotidos
Magnesio->cofactor para activar DNA polimerasa
Que son los dNTPs
Desoxinucleotidos libres en forma trifosfatada-> eso le da estabilidad
Los fosfatos le ayudan a formar el enlace fofodiester-> nucleotido-nucleotido
Proceso de amplificación
- Desnaturalización->separa hebras. Puentes de H se rompen con calor
- Ciclos de amplificación->se repite 35 veces el ciclo
- Amplificación final->para darle tiempo a la polimerasa de llenar los huecos q no lleno
- Almacenamiento temporal
Describió una modificación de la técnica de PCR tiempo final
Higuchi
Pasos PCR tiempo real
Amplificación
-desnaturalización
-alineamiento
-extensión
Detección->mediante fluorescencia
-SYBER green
-TaqMan
Fluorescencia que se utiliza para análisis de expresión, es inespecifico.
En medio de la cadena se pone bromuro de etidio->solo se adhiere si es cadena doble
SYBER green
Fluorescencia que se utiliza para genotipificar: identifica SNPs y regiones especificas
TaqMan
Quienes marcan el sitio de inicio de transcripción y le dicen a la polimerasa que se pegue para que haga otra cadena en TaqMan
Primers
Que es la sonda
Pedazo de AND complementario a la base
Polimerasa avanza y rompe la sonda en pedazos entonces
Se separa el fluoroforo y hay fluorescencia
Ventajas de PCR tiempo real
Posible calcular la eficiencia de la reacción
No necesario correr geles de agarosa para comprobar el resultado
Mayor rapidez y eficiencia en comparación a la d e punto final
Aplicaciones
Análisis de expresión-> CÁNCER
Investigación->estudios caso-control.Detección de polimorfismo asoc a enfermedades
Diagnóstico enfermedades->covid
Tipos de PCR
Convencional
Cualitativo
Semicuantitativo
Cuantitativo
Múltiple
Amplificación de una región genética esp
Se evalúa por medio de gel de agarosa o acrilamida
Diseñas oligo, flanqueas y haces múltiples copias
Convencional
Permite identificar presencia o ausencia de un fragmento specifico
Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Cualitativo
Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm)(biopsias)
Semicuantitativo
Permite medir la cantidad de microorganismos o en ARNm de un gen en particular
Como referencia una curva con muestras con concentraciones conocidas
Cuantitativo
Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR
Cada región cuenta con su pares de oligos
Múltiple
