PCR Flashcards
La PCR se caracteriza por:
Sensibilidad, reproductibilidad y eficiencia
¿Cuáles son las dos técnicas que existen?
- Cuantitativa
- Cualitativa
Cuantitativa
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
¿Cuál es el objetivo de la PCR en tiempo real?
Detectar y cuantificar las secuencias específicas de ac. nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en reacción.
¿A qué se refiere el término en tiempo real?
A que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción
La PCR no nos permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra. V/F
Falso. Si nos permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra
Cualitativa
Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa
¿Qué es la PCR?
Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada
¿Qué enzima utiliza la PCR?
ADN polimerasa (pq tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células)
¿Cuándo se utiliza el ADNc?(ADN complementario)
Cuando utilizamos el ARNm de algún gen de interés
La técnica se divide en 3 partes: ¿Cuáles?
- Desnaturalización
- Hibridación
- Extensión
Para realizar la reacción se usan aparatos llamados
Termocicladores (que contienen un software que genera gráficas)
¿Por qué se usan termocicladores?
Establecen un sistema homógeno en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de sus ciclos
Se utilizan termocicladores para:
- Excitar el sistema de fluorescencia
- Capturar la señal de emisión del mismo
- Realizar el análisis cuantitativo
¿En qué se diferencian los termocicladores?
- En la fuente de energía (Lamparas de luz, diodos de emisión de luz y láseres)
- En las velocidades para disminuir e incrementar las temperaturas en cada etapa de la reacción
- En el número de muestras que puede soportar
¿Qué muestran las gráficas de los termocicladores?
Una de estas gráficas es la de la amplificación que muestra el curso y el progreso de la reacción, otra gráfica es la disociación que muestra la especificidad de la reacción
¿Cómo se denominan los productos de la PCR?
Amplicones
¿Dónde son analizados los amplicones (productos de la PCR)?
Electroforesis en gel de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa
¿En que consiste la electroforesis?
Consiste en la separación de grandes moléculas a traves de una matriz solida que funciona como filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica
- Utiliza un buffer o tampón
¿Cómo se mueven los ácidos nucleicos en el gel de agarosa?
Ya que el grupo fosfato les otorga una carga negativa—> los ác. nucleicos migran hacia el lado positivo.
¿Cuándo se usa ADN genómico y cuándo ADN complementario proveniente del ARNm?
- ADN genómico: PCR
- ADN complementario proveniente del ARNm: RT-PCR (enzima transcriptasa reversa)
¿La PCR en tiempo real y PCR se deben analizar ambas en gel de agarosa?
No, no es necesario que la PCR en tiempo real sea manipulada en un gel de agarosa para saber que fue exitosa la reacción
La enzima más usada se llama:
Taq polimerasa
Taq polimerasa
Origen
Proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus la cual vive en condiciones de temperaturas muy altas—–Su ADNpol es termoestable
¿Qué son los primers?
Son secuencias de oligonucleótidos que delimitan la secuencia blanco que desea amplificar y son complementarios a esta
Tamaño promedio de los primers
- 12-15 pares de bases
- La cantidad de G-C no debe esceder el 55% de la secuencia (pq tienen enlace triple)
¿Cuáles son las dos secuencias de primers usadas?
- Forward: sentido
- Reward: antisentido
DESNATURALIZACIÓN
- Las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95° durante 20-30 seg
¿Dé que depende el tiempo de desnaturalización?
- El tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la concentración de G-C es alta entonces será necesario más tiempo para romper sus uniones (tienen 3 enlaces)
AT tiene solo dos
HIBRIDACIÓN
- Los primers se unen al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
- Si la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente
¿Cuál debe ser la temperatura durante la hibridación?
- 50-60°C
EXTENSIÓN
- La Taq polimerasa actua sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica (rápida)
- Función catalítica: agrega dntp’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN
- Al final del ciclo se habran formado los amplicones
La extensión de las cadenas es en dirección de:
La síntesis de ADN: 5’ a 3’
¿Cuál es la temperatura óptima para la extensión?
72°C
¿Cuando utilizamos la PCR es suficiente hacer electroforesis?
No, se deben hacer más análisis, como la espectrometría de masas.
¿Cuál es el método más sensible para detectar y cuantificar los ác. nucleicos?
La PCR en tiempo real
¿Cuál es una de las aplicaciones más usadas para la PCR tiempo real?
Cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles de ARNm procedentes de células o tejidos
La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción de PCR tiempo real puede ser a partir de concentraciones bajas. V/F
Verdadero
Ingredientes en PCR tiempo real
Los ingredientes son los mismos que en PCR en punto final, solo que la enzima, los DNTP’s, Mg+, el buffer y el sistema de fluorescencia se venden en una solución conocida como Master MIX.
El agua se vende por separado y es libre de nucleasas
Especificaciones para los primers que se usarán
Los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar alta especificidad y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb
¿Cómo puede ser la cuantificación?
Absoluta y relativa
Cuantificación absoluta
- Sirve para conocer el número exacto de copias amplificadas o la concentración precisa de ác. nucleicos en una muestra
Sirve para medir carga viral o bacteriana en tejidos
Cuantificación relativa
- Se aplica cuando se desea evaluar los cambios de expresión de genes en distintos estados fisiológicos
(se buscan en el ARNm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen)
Qué relevancia tiene el alineamiento de secuencias?
Al alinear dos secuencias se pueden encontrar regiones similares, esto puede tener implicaciones evolutivas y funcionales
