Partie 3.3- biotechnologies microbiennes Flashcards
C’est quoi la biotechnologie
processu dans lequel organismes vivants sont manipulés par la biologie moléculaire pour donner produits utiles
C’est quoi les enzymes de restriction
enzymes microbiennes qui coupent l’ADNdb (endonucléases)
Comment faire la nomenclature des enzymes de restrictions (5 lettres)
1ere lettre=1ere lettre du genre bactérien
2&3eme lettre=lettres de l’espèce bactérienne
4eme lettre=souche bactérienne
5eme lettre=première,deuxième,troisième… enzyme découverte chez cette bactérie
4 étapes du fonctionnement des enzymes de restriction
1) enzyme mise en présence de ADNdb
2) enzyme lie à une séquence spécifique de l’ADN
3) enzyme coupe les 2 brins d’ADN à des endroits spécifiques
4) enzyme se libère de l’ADN
c’est quoi le principe du clonage (comment ça fonctionne)
fragement d’ADN à cloner est introduit dans un vecteur de clonage, le vecteur va être recombiné et introduit dans un organisme hôte pour la réplication
Comment l’ADNc est produit
transcriptase inverse synthétise une molécule d’ADN simple brin à partir de l’ARNm
Étapes du clonage (5)
1) séparation de l’ADN à cloner
2) utiliser jusqu’à 2 enzymes de restriction pour créer fragements d’ADN
3) utiliser l’ADN ligase pour construire le vecteur recombinant
4) plasmide recombinant inseré dans cellules hôte par transformation
5) réplication de l’ADN par divison cellulaire de la bactérie
C’est quoi la PCR
technique qui permet la synthése de nombreuse copies d’ADN à partir d’un mélange complexe
Quelle ADN polymérase themosensible est utilisée pour la PCR
Taq
4 Étapes de la réaction PCR
1) dénaturation de l’ADN (95°C)
2) hybridation des amorces complémentaires
3) élongation par l’ADN polymérase (72°C)
4) répétition de ces étapes 30-40 fois
4 grands types de vecteurs
1) plasmides
2) vecteurs phagiques (virus)
3) cosmides
4) chromosomes artificiels
C’est quoi les plasmides
petites molécules circulaire d’ADN capables de répliquer leur ADN indépendamment. Clonent fragement de plus de 30kb
c’est quoi les vecteurs phagiques
génomes de phages modifiés génétiquement et servent à cloner des fragements de tailles définies
C’est quoi les cosmides
vecteur hybride de phage et plasmide (entièrement synthétiques) servent à cloner fragements d’au plus 45kb
C’est quoi les chromosomes artificiels
vecteurs de clonage spéciaux pour clonage de larges fragements (300-400kb)
3 points communs des vecteurs de clonage
1) origine de réplication
2) marqueur de sélection
3) multisite de clonage (MSC)
Rôle de l’origine de clonage
permet la réplication du plasmide dans cellule hôte independamment du chromosome bactérien
Rôle du marqueur de sélection
permet de différencier les cellules qui ont pris le vecteur (cellules transformées vs non tranformées)
Rôle du multisite de clonage
site contenant plusieurs sites de restriction . essentiel à l’insertion de l’ADN étranger
2 façons dont l’insertion de l’ADN recombinant peut se faire
1) transformation
2) électroporation
c’est quoi l’électroporation
application d’une impulsion électrique qui rend les membranes perméables temporairement et permettent l’absorption de l’ADN étranger
2 modifications additionnelles possibles pour le vecteur
ajout de régions régulatrices, ajout de marqueur pour purifier/detecter protéines récombinantes
c’est quoi le marquage poly-HIS
méthode pour purifier les protéines recombinantes
Principe du marquage poly-HIS
ajout de résidus d’histidine à l’extermité de la protéine (N ou C). Protéines marquées sont retenues et élués. Marqueur enlevé par enzyme
2 types de marquage fluorescent
1) fusion transcriptionnelle
2) fusion traductionnelle
C’est quoi la fusion transcriptionnelle dans le marquage fluorescent
technique qui permet l’étude de la régulation du gène en remplacent le gène d’interet par gène codant pour protéine fluorescente
C’est quoi la fusion traductionnelle dans le marquage fluorescent
ajout d’un gène qui code pour une protéine fluorescente au gène d’interet (création de protéine chimérique)
3 types d’endonucléases (ciseaux moléculaires)
1) nucléases à doigt de zinc
2) nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs)
3) système CRISPR-cas9
c’est quoi l’édition génomique
endonucléases modifiées qui introduisent des coupures double brin à un endroit précis
2 mécanismes de réparation des coupures double brin
1) jonction d’extrémités non homologues
2) recombinaison homologue
2 composantes de l’édition génomique ZFN et leur rôle
1) doigt de zinc qui reconnait des triplets de nucléotides précis
2) FokI: rare enzyme de restriction où l’activité de nucléase est séparée de l’activité de reconnaissance
2 composantes fusionnées pour créer TALENs et leur rôle
partie TALE- partie capable de reconnaitre portion d’ADN spécifique
Partie N: capable de couper brin d’ADN (nucléase)
Principe de TALENS
après que l’ADN est coupé, un gène cible peut être enlevé et remplacé par un nouveau gène réparé. Plus pratique que ZFN mais plus couteux que CRISPR
Principe de CRISPR
fragements d’ADNdb viral intégrés dans loci particulier et si la cellule rencontre un ADN étranger identique, l’ADN sera détruit par enzymes
