Partie 3.3- biotechnologies microbiennes Flashcards
C’est quoi la biotechnologie
processu dans lequel organismes vivants sont manipulés par la biologie moléculaire pour donner produits utiles
C’est quoi les enzymes de restriction
enzymes microbiennes qui coupent l’ADNdb (endonucléases)
Comment faire la nomenclature des enzymes de restrictions (5 lettres)
1ere lettre=1ere lettre du genre bactérien
2&3eme lettre=lettres de l’espèce bactérienne
4eme lettre=souche bactérienne
5eme lettre=première,deuxième,troisième… enzyme découverte chez cette bactérie
4 étapes du fonctionnement des enzymes de restriction
1) enzyme mise en présence de ADNdb
2) enzyme lie à une séquence spécifique de l’ADN
3) enzyme coupe les 2 brins d’ADN à des endroits spécifiques
4) enzyme se libère de l’ADN
c’est quoi le principe du clonage (comment ça fonctionne)
fragement d’ADN à cloner est introduit dans un vecteur de clonage, le vecteur va être recombiné et introduit dans un organisme hôte pour la réplication
Comment l’ADNc est produit
transcriptase inverse synthétise une molécule d’ADN simple brin à partir de l’ARNm
Étapes du clonage (5)
1) séparation de l’ADN à cloner
2) utiliser jusqu’à 2 enzymes de restriction pour créer fragements d’ADN
3) utiliser l’ADN ligase pour construire le vecteur recombinant
4) plasmide recombinant inseré dans cellules hôte par transformation
5) réplication de l’ADN par divison cellulaire de la bactérie
C’est quoi la PCR
technique qui permet la synthése de nombreuse copies d’ADN à partir d’un mélange complexe
Quelle ADN polymérase themosensible est utilisée pour la PCR
Taq
4 Étapes de la réaction PCR
1) dénaturation de l’ADN (95°C)
2) hybridation des amorces complémentaires
3) élongation par l’ADN polymérase (72°C)
4) répétition de ces étapes 30-40 fois
4 grands types de vecteurs
1) plasmides
2) vecteurs phagiques (virus)
3) cosmides
4) chromosomes artificiels
C’est quoi les plasmides
petites molécules circulaire d’ADN capables de répliquer leur ADN indépendamment. Clonent fragement de plus de 30kb
c’est quoi les vecteurs phagiques
génomes de phages modifiés génétiquement et servent à cloner des fragements de tailles définies
C’est quoi les cosmides
vecteur hybride de phage et plasmide (entièrement synthétiques) servent à cloner fragements d’au plus 45kb
C’est quoi les chromosomes artificiels
vecteurs de clonage spéciaux pour clonage de larges fragements (300-400kb)
3 points communs des vecteurs de clonage
1) origine de réplication
2) marqueur de sélection
3) multisite de clonage (MSC)
Rôle de l’origine de clonage
permet la réplication du plasmide dans cellule hôte independamment du chromosome bactérien
Rôle du marqueur de sélection
permet de différencier les cellules qui ont pris le vecteur (cellules transformées vs non tranformées)
Rôle du multisite de clonage
site contenant plusieurs sites de restriction . essentiel à l’insertion de l’ADN étranger
2 façons dont l’insertion de l’ADN recombinant peut se faire
1) transformation
2) électroporation
c’est quoi l’électroporation
application d’une impulsion électrique qui rend les membranes perméables temporairement et permettent l’absorption de l’ADN étranger
2 modifications additionnelles possibles pour le vecteur
ajout de régions régulatrices, ajout de marqueur pour purifier/detecter protéines récombinantes
c’est quoi le marquage poly-HIS
méthode pour purifier les protéines recombinantes
Principe du marquage poly-HIS
ajout de résidus d’histidine à l’extermité de la protéine (N ou C). Protéines marquées sont retenues et élués. Marqueur enlevé par enzyme