november 2015 Flashcards
Ovenfor er vist et lysmikroskopisk billede af et væv.
1.
a. Angiv navn for A-D.
b. Redegør for dannelse af struktur A.
1.
a) A: Haversk system/Cortikalt osteon, B: Haversk kanal, C: Canaliculi, D: Lakune/osteocyt.
b) Det Haverske system er opstået ved aktivitet af osteoklaster, der har udhulet en tunnel med en diameter på typisk omkring 150 μm igennem allerede eksisterende knoglevæv. Efterfølgende har osteoblaster sat sig på tunnelens sider og har ved successive bølger af aktivitet deponeret osteoid, der efterfølgende mineraliseres. Dette giver ophav til en indadrettet knoglevækst med lagvis indfangning af osteoblaster i lakuner (som i D). Osteoblast aktivitet ophører og efterlader en Haversk kanal (som i B), der indeholder løst bindevæv, nerver og karforsyning.
Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.
Angiv hvor i den sekretoriske pathway nysyntetiserede opløselige proteiner med mannose-6-fosfat er lokaliseret.
De opløselige proteiner ville være lokaliseret i lumen af lysosomer.
Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.
Angiv hvor i den sekretoriske pathway nysyntetiserede opløselige proteiner, som indeholder et ER retention signal (KDEL-signal i proteinets C-terminale ende), er lokaliseret.
De opløselige proteiner ville være lokaliseret i lumen af ER (evt. en lille mængde i cis siden af Golgi apparatet).
Nysyntetiserede opløselige proteiner, som translokeres til ER lumen, vil efter 2 timer have opnået deres endelige destination. Ved hjælp af proteinsyntese inhibitorer og proteiner som er mærket (”tagged”) med green fluorescent protein (GFP) er det muligt at følge, hvorledes specifikke proteiner transporteres/lokaliseres i den sekretoriske pathway i celler i kultur.
I spørgsmål 1-3 antages det, at proteinerne påvises 120 minutter efter at proteinsyntesen er inhiberet.
Forklar hvorvidt det er muligt at lokalisere nysyntetiserede, opløselige proteiner, indeholdende en mutation der ødelægger ER retention signalet, i cellerne.
Hvis retention signalet er ødelagt, vil de opløselige proteiner efter 120 minutter være secerneret via den konstitutive exocytotiske pathway, og således vil de opløselige proteiner ikke kunne lokaliseres i cellen. Alternativt kan der svares, at de opløselige proteiner på grund af mutationen bliver nedbrudt, hvorfor de ikke kan lokaliseres i cellen.
Proteiner, som translokeres til ER lumen, kan modificeres co- og posttranslationelt.
4. Beskriv funktionen af to proteinmodifikationer der typisk foregår i lumen af ER.
Proteiner kan N-glykosyleres i ER. Glykosylering kan beskytte proteiner mod nedbrydning, tilbageholde proteiner i ER indtil de er korrekt foldede, indgå i dannelsen af den beskyttende glycocalyx og fungere i cellegenkendelse.
Proteiner kan danne disulfid-bindinger i ER. Disulfid-bindinger hjælper med at stabilisere proteiners struktur (især når proteiner udsættes for f.eks. nedbrydende enzymer eller ændringer i pH uden for cellen).
Genekspression
Ekspressionen af Interleukin 2 genet reguleres (i eukaryote celler) af DNA sekvenselementet ARRE2, som genkendes af tre forskellige transskriptionsfaktorer, cFos, cJun og NFAT. Under studiet af reguleringen af Interleukin 2 genet udførtes et genekspressions- og et EMSA (”electrophoretic mobility shift assay”) eksperiment som vist i figur 1 og 2.
Figur 1 viser et cellekulturforsøg, hvor de anvendte celler udtrykker forskellige kombinationer af cFos, cJun og NFAT (1-4). Cellerne er yderligere transfekteret med en vektor indeholdende rapportørgenet β-Gal (som koder for enzymet β-galactosidase) og et sekvenselement, ARRE2, opstrøms for transskriptionsstart (angivet med pil). Efterfølgende er ekspressionen af β-galactosidase protein målt, som et udtryk for transskriptionsaktivitet. (Efter Petersen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996).
a. Redegør for resultatet af forsøget i figur 1 i relation til transskriptionsreguleringen af Interleukin 2 genet.
b. Angiv hvilket enzym som syntetiserer Interleukin 2 mRNA.
c. Redegør for hvorfor β-gal ofte anvendes i denne type forsøg i stedet for det oprindelige gen (her Interleukin 2).
1.
a. Ud fra figur 1 kan det observeres, at initiering af transskriptionen af β-gal genet kun kan foregå i nærvær af alle tre proteiner: NFAT, cFos og cJun, Det kan derfor konkluderes, at NFAT, cFos og cJun er genregulatoriske proteiner nødvendige for initiering af transskription af Interleukin 2 genet.
b. RNA polymerase II (idet der transskriberes mRNA).
c. β-galactosidase anvendes meget ofte som rapportørgen, idet enzymaktivitet let og kvantitativt kan måles (kolorimetrisk) i modsætningen til det oprindelige genprodukt.
Figur 2 viser et EMSA eksperiment med DNA indeholdende ARRE2 sekvenselementet og proteinerne AP-1 (som er en heterodimer af cJun og cFos) og NFAT i forskellige koncentrationer. (Efter Petersen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996).
2.
a. Redegør kort for EMSA metoden.
b. Forklar resultatet af forsøget i figur 2.
2.
a. I et EMSA forsøg analyseres ændringer i migrationen af et DNA fragment (som kan detekteres vha. radioaktiv (32P) - eller fluorescens-mærkning) ved gel-elektroforese, som adskiller DNA efter størrelse. Migrationen af et DNA fragment reduceres, såfremt dette binder protein(er).
b. I dette forsøg vises at både AP-1 og NFAT transskriptionsfaktorerne binder til ARRE2. Bånd 1 er frit DNA indeholdende ARRE2; bånd 2 er NFAT bundet til DNA indeholdende ARRE2 og bånd 3 er NFAT og AP-1 bundet til DNA indeholdende ARRE2 (eller evt. kun AP-1, idet det ikke ud fra dette forsøg kan konkluderes om NFAT og AP-1 binder samtidigt til hver sit bindingssted, eller binder til samme bindingssted. Se dog opgave 1 som viser, at både NFAT og cfos og cjun (AP-1) er nødvendige for aktivitet, og opgave 4, som viser at NFAT og AP-1 binder samtidigt).
Figur 3 viser strukturen (bestemt ved røntgen-krystallografi) af protein-DNA komplekset mellem NFAT (gul/grøn), AP-1 (rød/lilla) og sekvenselementet ARRE2.
- Beskriv ud fra figur 3 de strukturelle forskelle mellem de to proteiner NFAT og AP-1,
herunder hvorledes AP-1 binder til og genkender ARRE2 DNA elementet.
NFAT er primært opbygget af β-strands/sheets og loops, hvorimod AP-1 er en heterodimer bestående af to strukturelt identiske subunits (cFos og cJun), som hver for sig er en sammenhængende α-helix. cFos og cJun binder til hinanden (via en ”leucin-zipper”), og begge binder til DNA helixen via en α-helix, som genkender DNA sekvensen (i major groove via hydrogenbindinger mm.). ECB, 4. udgave, kapitel 4 og 8.
Sensorisk signalering
En forsker undersøger en ukendt sansereceptor ved at måle frekvensen af aktionspotentialer i axonet. Han stimulerer sansereceptoren med en konstant stimulus, og får resultatet nedenfor (forsøg 1), hvor frekvensen af aktionspotentialer er angivet som funktion af tiden:
Forskeren fjerner nu Ca2+ fra ekstracellulærvæsken, og gentager forsøget (forsøg 2). Han opdager, at receptoren ikke længere adapterer.
1. Angiv hvordan stimulusamplituden kodes i receptorens modtagerdel og aftagerdel.
2. Redegør kort for funktionen af KA-kanaler i kodningen af stimulusintensiteten.
13
3. Redegør for en mekanisme, der kan være ansvarlig for den adaptation, der ses i forsøg 1.
4. Redegør for, hvorfor sansereceptoren ophører med at fyre aktionspotentialer efter at stimulus fjernes i forsøg 1, og angiv herunder, hvorvidt det kan forventes at denne pause optræder i forsøget uden Ca2+ i ekstracellulærvæsken (forsøg 2).
Sensorisk signalering.
1. Stimulusamplituden kodes i receptorens modtagerdel i generatorpotentialets amplitude og i afsenderdelen i frekvensen af aktionspotentialer.
2. KA-kanalerne nedsætter fyringsfrekvensen og gør frekvensen afhængig af generatorpotentials amplitude og dermed af stimulusstyrken. KA-kanalerne er derfor vigtige for kodning af stimulusstyrken i receptorens afsenderdel.
24
3. Da adaptation er fraværende, når Ca2+ fjernes ekstracellulært, er det formentlig Ca2+-influx i receptorens afsenderdel, der er involveret. Spændingsafhængige Ca2+-kanaler åbner under aktionspotentialet, hvilket medfører Ca2+-influx og stadig kraftigere aktivering af KC-kanaler hen igennem impulstoget, hvilket medfører en længere hyperpolariseringsfase mellem aktionspotentialerne, og derfor nedsætter frekvensen.
4. Når stimulus og dermed generatorpotentialet fjernes, hyperpolariseres receptoren pga. den akkumulerede Ca2+, som aktiverer Kc-kanalerne. Først når Ca2+ er pumpet ud, kan receptoren genoptage fyringen af aktionspotentialer. Da pausen afhænger af Ca2+-influx, forventer man ikke at se nogen pause i forsøget uden ekstracellulær Ca2+. (Hvis studenten ikke har identificeret mekanismen korrekt i spørgsmål 3, så kan et svar, hvor der henvises til den nedsatte følsomhed af receptoren pga adaptationen stadig anses for delvist korrekt).
