4. maj 2020 Flashcards
NKCC1 er en elektroneutral co-transportør, som bl.a. er vigtig for regulering af cellevolumen, og som transporterer ioner fra det ekstracellulære rum til det intracellulære rum i forholdet
1 Na+ : 1 K+ : 2 Cl−.
1. Redegør for hvorledes transporten foregår.
Epidermale keratinocytter får tilsat et 37 ◦C varmt medie med fysiologiske ionkoncentrationer (samt glukose, vitaminer og aminosyrer). Den intracellulære Cl- koncentration er 5 mM og cellernes membranpotential er -70 mV.
2. Redegør for hvorvidt Cl- transport via NKCC1 foregår med eller imod klorids elektrokemiske gradient.
- Redegør for alle strukturniveauer af en funktionel NKCC1 transportør.
4.
a. Redegør kort for hvorvidt man vil forvente, at celler kan dyrkes i lang tid i et medie, som det der er angivet under spørgsmål 2.
(Epidermale keratinocytter får tilsat et 37 ◦C varmt medie med fysiologiske ionkoncentrationer (samt glukose, vitaminer og aminosyrer). Den intracellulære Cl- koncentration er 5 mM og cellernes membranpotential er -70 mV.)
b. Beskriv en pathway som stimulerer celler til at overleve.
4.
a. (Det anvendte medie indeholder udelukkende fysiologiske ionkoncentrationer, samt glukose, vitaminer og aminosyrer). Da der i mediet ikke er signalstoffer (f.eks. ligander for RTK i serum), som ville kunne igangsætte overlevelsessignalering, vil cellerne ikke kunne dyrkes i dette medie over længere tid. ECB, 5. udgave, kapitel 16, materiale til Sau23.
b. Beskrivelse svarende til figur 16.32 og 16.33 i ECB, 5. udgave, kapitel 16.
- Redegør for om Bcl-2 er en tumor suppressor eller et proto-onkogen.
Human lipoprotein lipase (human LPL) katalyserer hydrolysen af triacylglyceroler i chylomikroner og VLDL, hvorved der dannes fedtsyrer, som kan oplagres i fedtvæv. Nedenstående sekvens viser en del af 5’ opstrømsregionen samt hele exon 1 for det humane LPL gen.
- Redegør for hvor mange nukleotider som udgør 5’UTR regionen i den humane LPL mRNA.
- Redegør for den mest sandsynlige konsekvens en deletion fra position -140 til position -6 vil have for ekspressionen af det humane LPL gen.
En mutation forårsager indsættelse af 2 basepar, 5’-TG-3’, efter A på position +173 i det humane LPL gen.
3. Redegør for hvilken betydning dette har for længden af det dannede humane LPL mRNA.
En mutation forårsager indsættelse af 2 basepar, 5’-TG-3’, efter A på position +173 i det humane LPL gen.
- Redegør for hvilken betydning dette har for længden af det dannede humane LPL protein.
Positionen -300 til positionen -145 ønskes amplificeret ved hjælp af PCR.
5. Angiv sekvenserne (16 nukleotider med orientering) på de 2 primere som skal anvendes til denne amplifikation.
- Redegør for hvorledes proteinet er lokaliseret i plasmamembranen. Svaret skal inkludere orientering af proteinet, samt antal transmembrane segmenter.
- Redegør for om området markeret ved ”A” i figur 1 kan blive N-glykosyleret.
- Redegør for funktionen af 2 intracellulære receptorer som har betydning for, at et lysosomalt hydrolytisk enzym kan transporteres til lysosomer.
Proteiner, som skal fungere i henholdsvis mitokondriers matrix og lumen af peroxisomer, syntetiseres på frie ribosomer i cytosolen og transporteres herefter til deres destination (undtaget er de proteiner, som mitokondrierne selv syntetiserer).
4. Beskriv 2 forskelle mellem disse proteiners transport fra cytosol til mitokondriers matrix og lumen af peroxisomer.
Proteiner, som importeres til lumen af peroxisomer ved hjælp af et C-terminalt signal på tre aminosyrer (Ser-Lys-Leu), genkendes af en importreceptor, Pex5, i cytosolen. For at undersøge rollen af Pex5 i denne import, blev et Pex5 konstrukt (Pex5-flag) fremstillet (se figur 2A), indeholdende:
i. en N-terminal peptid-sekvens med et kløvningssite for en protease, som kun forekommer i lumen af peroxisomer.
ii. en FLAG-sekvens, som kan genkendes af specifikke antistoffer.
Det konstruerede Pex5-flag protein fungerer som normalt Pex5.
Der blev udført en western blot analyse af forskellige fraktioner fra celler der udtrykker Pex5-flag: intakte celler (IC), oprensede peroxisomer (P) og oprenset cytoplasma (Cy). Der blev benyttet to antistoffer: Ab1, som genkender både kløvet og ukløvet Pex5-flag, og Ab2, som kun genkender Pex5-flag, når den N-terminale peptidsekvens er kløvet fra (Figur 2B og C).
- Forklar hvad det teoretiske resultat 1 og 2 på figur 2B viser i forhold til Pex5’s mulige rolle i protein-import til lumen af peroxisomer.
- For teoretisk resultat 1 ses ingen bånd med Ab2, hvilket viser, at der ikke er kløvet Pex5-flag i cellerne. De bånd, som ses i western blottet med Ab1, er således ukløvet Pex5-flag protein. Dette teoretiske resultat viser, at Pex5 ikke kommer med ind i lumen af peroxisomerne under protein-import.
For teoretisk resultat 2 ses to bånd for IC, som viser, at der er både ukløvet og kløvet Pex5-flag i cellerne, hvilket tyder på, at en del af Pex5-flag er transporteret ind i lumen af peroxisomerne. Dette understøttes af, at der ses et bånd for kløvet Pex5-flag i P fraktionen og et bånd for ukløvet Pex-flag i Cy fraktionen. Dette teoretiske resultat viser, at Pex5 transporteres med ind i lumen af peroxisomerne under protein-import (og at det ikke returnerer til cytosolen igen). ECB, 5. udgave, kapitel 15.
I figur 2C ses, at de eksperimentelle resultater fra forsøg udført på celler, som udtrykker Pex5-flag, stemmer overens med det teoretiske resultat 3 i figur 2B.
6. Forklar Pex5’s rolle i protein-import til lumen af peroxisomer på baggrund af resultaterne i figur 2C.
I. Aktionspotentialet og membranpotentialet
En studerende stimulerer og måler aktiviteten i nervus ischiadicus på en rotte. Nerven er uddissekeret og ligger i et forsøgskammer fyldt med ekstracellulær væske som indeholder Na+ (145 mM), K+ (5 mM), Cl- (106 mM) og Ca2+ (1mM).
Stimulation og registrering foregår ved ekstracellulære elektroder nummereret 1 til 9 (se figur 1). Afstanden mellem elektroderne er 10 mm. Man stimulerer nerven i den distale ende og registrerer aktiviteten i den proksimale ende.
Anoden er sat til bøsning 1 og katoden til bøsning 2.
1) Redegør kort for, hvorfor man placerer anoden i bøsning 1 og katoden i bøsning 2 (og ikke omvendt).
Måleelektroderne placeret i bøsninger 5 og 6 er forbundet til en differentialforstærker, som har to indgange markeret plus (+) og minus (–). Kort efter stimulationen registrerer man et difasisk aktionspotential (se figur 1).
2) Redegør kort for, hvilken elektrode (5 eller 6) der er forbundet til forstærkerens plus (+) indgang.
Den studerende registrerer et aktionspotential flere steder langs nerven ved at flytte registreringselektroderne fra følgende bøsningspar (5 og 6; 6 og 7; 7 og 8; 8 og 9) (se figur 2).
3) Redegør for, hvordan man kan beregne nerveledningshastigheden for de hurtigste axoner.
4) Beregn en rimelig værdi for nerveledningshastigheden (i meter per sekund) ved at bruge aflæste værdier fra målingerne.
5) Redegør kort for, hvorfor aktionspotentialets amplitude bliver mindre, når man måler det længere væk fra stimulationselektroderne.
Den studerende beslutter at skifte ekstracellulærvæsken over hele nerven. Han fylder kammeret med en ekstracellulærvæske som indeholder Na+ (145 mM), K+ (140 mM), Cl- (106 mM) og Ca2+ (1mM).
6) Redegør kort for, hvordan de 2 faser af aktionspotentialet (den positive og den negative) bliver påvirket.
- Der sker en hyperpolarisering under anoden og en depolarisering under katoden. Der er en risiko for, at aktionspotentialet, som starter ved katoden, bliver blokeret under anoden.
- Forstærkeren måler det, der foregår ved (+) elektroden minus det der foregår ved (-) elektroden: (+) - (-). Aktionspotentialet passerer først elektrode 5. Da man måler et positivt udslag, kan man konkludere, at elektrode 5 er forbundet til (-) og elektrode 6 til (+) indgangen, fordi aktionspotentialet skaber et negativt potential i ekstracellulærrummet, og første udslag i målingen er positiv.
- Hastigheden er lig med afstanden per tidsenhed. Aktionspotentialet starter ved katoden. Man kan lave en graf, som illustrerer starttiden for aktionspotentialet i forhold til afstanden mellem katoden og den proksimale måleelektrode. Man kan derefter tegne en trendlinje igennem de afsatte punker. Hastigheden er lig med den reciprokke hældning af trendlinjen.
- 100 m/s (man accepterer værdier mellem 80 og 120 m/s).
- Amplituden af nervens aktionspotential er afhængig af både summen og synkroniciteten af aktionspotentialerne i nervens individuelle axoner. Nerven indeholder axoner som har forskellige konduktionshastigheder. Jo længere væk man måler fra katoden, desto mindre synkrone er axonerne. Derfor falder amplituden. Hertil kommer at nerven er tykkere med flere axoner jo længere væk man kommer fra stimulationselektroden (proximalt). (Disse axoner er ikke aktiveret med stimulus da de forlader nerven som kollateraler, men bidrager til en mindre samlet aktionspotential amplitude grundet deres elektrisk isolerende bidrag).
- Kaliums ligevægtspotential bliver lig ca. 0 mV. Da membranen er mest permeabel for kalium, bliver membranen depolariseret (tæt på 0 mV). Det medfører at alle natrium ionkanaler er inaktiveret. Derfor er det ikke muligt, at generere et aktionspotential. De 2 faser forsvinder. Øvelsesvejledning øvelse 2.
Et neuron studeres af et par forskere. Forskerne har placeret to intracellulære måleelektroder (E1 og E2, figur 3) i en dendrit, som vist i tegningen nedenunder. Neuronet modtager synaptisk input fra synapserne A og B, og forskerne har placeret stimulationselektroder (ikke vist på tegningen), som sætter dem i stand til at udløse aktionspotentialer i axonerne tilhørende synapserne A og B. (Se figur 3)
Forskerne stimulerer nu axonet der fører til synapsen A så det affyrer et enkelt aktionspotential. Efter aktionspotentialet er nået til synapsen A måler forskerne membranpotentialet i neuronet med elektroderne E1 og E2. Resultaterne varierer fra forsøg til forsøg, men i gennemsnit får forskerne følgende resultat (figur 4).
- Angiv betegnelserne for membranpotentialændringerne og angiv de ionstrømme der er involveret.
- Redegør for, hvorfor depolariseringen målt med elektroden E2 har mindre amplitude end depolariseringen målt med elektroden E1.
Forskerne stimulerer nu axonet, der fører til synapsen B, så det affyrer et enkelt aktionspotential. Umiddelbart efter at aktionspotentialet er nået til synapsen B måler forskerne igen membranpotentialet med elektrode E2, og får flg resultat (figur 5). - Angiv en receptor og de tilhørende ionfluxe der kunne være involveret i at skabe membranpotentialændringen.
Forskerne stimulerer nu først synapse B, og umiddelbart efterfølgende synapse A. De måler nu med elektroden E2 membranpotentialet og får i gennemsnit flg. Resultat (figur 6).
4a. Redegør for, hvorfor depolariseringen udløst af synapse A har mindre amplitude end ovenfor (i spørgsmål 2) når den måles lige efter aktivering af synapse B.
4b. Angiv betegnelsen for det fænomen forskerne har udløst.
Forskerne stimulerer nu synapsen A til at fyre et aktionspotential per sekund (1 Hz) gennem et stykke tid (flere minutter). Da de efter en pause stimulerer synapse A til at fyre ét aktionspotential måler forskerne nu igen membranpotentialet med elektroderne E1 og E2. De får i gennemsnit flg. Resultater (figur 7).
5a. Redegør for, hvorfor membranpotentialændringerne målt med elektroderne E1 og E2 nu begge har mindre amplitude end ovenfor (i spørgsmål 2).
5b. Angiv betegnelsen for det fænomen forskerne har udløst.
6. Angiv et estimat for dendrittens længdekonstant, , når:
a. synapsen A er aktiveret alene (som i spørgsmål 1-2)
b. synapsen A aktiveres efter synapsen B (som i spørgsmål 4, hvor du kan gå ud fra at målingen ved elektrode E1 er uændret, som i spørgsmål 1-2)
c. synapsen A aktiveres alene efter et 1 Hz aktionspotential-tog (som i spørgsmål 5).
- Excitatorisk Post-Synaptisk Potential (EPSP), og ionstrømmene er en influx af Na+ og en (mindre) efflux af K+.
- Målingen ved elektrode E2 har mindre amplitude, fordi noget af den elektriske strøm lækker ud af dendritten mellem elektroderne E1 og E2 gennem ionkanaler (eller membran-modstanden Rm; de studerende nævner måske at amplituden aftager pga. længdekonstanten ). Dermed kommer mindre depolariserende strøm frem til E1.
- GABAA-receptor (eller GABAC-receptor) og ionstrømmen er en influx af Cl- (svarende til en udadgående elektrisk strøm; dette forventes ikke nævnt). Glycin-receptor og ionstrømmen er en influx af Cl-. GABAB-receptor og ionstrømmen er en efflux af K+. Kun én mulighed skal nævnes for et fyldesgørende svar.
4a. Den mindre amplitude skyldes at åbningen af Cl–selektive (eller K+-selektive) kanaler ved synapse B gør at den elektriske strøm lækker ud af dendritten (pga influx af Cl- eller efflux af K+). Dermed kommer endnu mindre strøm frem til E2 end før.
4b. Dette kaldes shunting inhibition (eller ’divisive inhibition’; dette forventes ikke nævnt).
5a. Fænomenet udløses af et lav-frekvent tog af aktionspotentialer (1 Hz), der medfører en begrænset influx af Ca2+ gennem NMDA-receptorer. Dette aktiverer calcineurin (en protein fosfatase), der aktiverer protein fosfatase 1. Tilsammen vil de to phosphataser defosforylere AMPA-receptorer, der så optages i postsynapsen ved endocytose. Som følge heraf vil der være færre receptorer til at lede strøm ind i postsynapsen, og EPSPerne bliver mindre.
5b. Det fænomen forskerne har udløst kaldes Long-Term Depression (LTD).
6.
a. (I spørgsmål 1-2 har EPSPet amplitude 20 mV (=-40 mV -(-60 mV)) når det måles med E1, men amplituden 7,4 mV (=-52,6 mV -(-60mV)) når det måles med E2. Vi regner 7,4 mV/20 mV = 0,37. Dette er det fald der forventes efter én længdekonstant (det forventede fald er 1/e = 37%)). Da der er 2 mm mellem elektroderne er længdekonstanten () derfor 2 mm.
b. (I spørgsmål 4 er EPSPets amplitude ved E2 målt til 2,7 mV (=-67,3 mV - (-70 mV)). Det er 37% af 37% af 20 mV (20 mV x 0,37 x 0,37 = 2,738 mV)). Da der er to længdekonstanter mellem E1 og E2 er længdekonstanten 2mm/2 = 1 mm.
c. (I spørgsmål 5 er EPSPets amplitude 3,7 mV (=-56,3 mV - (-60 mV)) målt med elektrode E2, men 10 mV målt med elektrode E1. Dvs faldet fra E1 til E2 er til 3,7/10 = 37 %). Der er én længdekonstant mellem E1 og E2, og længdekonstanten er 2 mm.
BKM (3. ed), p. 56-58, 140-146, 171-172, 179-181. Øvelsesvejledning øvelse 2.
Kontraktioner i tværstribet muskulatur aktiveres af aktionspotentialer.
a. Beskriv kort den væsentligste forskel mellem skelet og hjerte-muskulaturs aktionspotentialer.
b. Redegør for den funktionelle betydning af denne forskel.
En isoleret tværstribet muskel monteres i en myograf og stimuleres med enkelt stimuli via to extracellulære elektroder. Efterhånden som stimulusstyrken øges, opstår der kontraktioner og kontraktionskraften stiger med stimulusstyrken indtil et maksimum nås. Herefter stiger kraften ikke yderligere med øget stimulusstyrke.
c. Redegør for, hvilken tværstribet muskulatur der er tale om.
d. Redegør for kontraktionskraftens udvikling med stigende stimulusstyrke i den anden type tværstribet muskulatur.
