2017 novemberr Flashcards
Visse celletyper i tarmepitelet absorberer Cl- og andre er i stand til at secernere Cl-. Kryptcellerne i tarmepitelet udtrykker en Cl- kanal ved navn cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), som er lokaliseret i den apikale membran (ud mod tarmlumen). Cl- koncentrationen i tarmlumen varierer med indholdet i lumen.
- Angiv ligevægtspotentialet for Cl- over den apikale membran ved en Cl- koncentration i lumen på 100 mM og en [Cl-]i på 15 mM.
- -50 mV (svar fra -48 mV til -51 mV accepteres).
Membranpotentialet i en kryptcelle i tarmepitelet sættes til -60 mV.
- Redegør for hvilken vej Cl- vil bevæge sig henover den apikale membran.
(Visse celletyper i tarmepitelet absorberer Cl- og andre er i stand til at secernere Cl-. Kryptcellerne i tarmepitelet udtrykker en Cl- kanal ved navn cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), som er lokaliseret i den apikale membran (ud mod tarmlumen). Cl- koncentrationen i tarmlumen varierer med indholdet i lumen.
- Angiv ligevægtspotentialet for Cl- over den apikale membran ved en Cl- koncentration i lumen på 100 mM og en [Cl-]i på 15 mM.)
- Grundet sin negative ladning vil Cl- bevæge sig ud af cellen for at opnå sit ligevægtspotential, der er mindre negativt end membranpotentialet.
Infektion med koleratoxin giver en voldsom diarré, som bl.a. opstår som følge af at koleratoksinet ADP-ribosylerer trimere Gs proteiner i tarmepitelet. Denne modifikation medfører, at Gs proteinets GTPase aktivitet nedsættes.
- Redegør for ændringen i den intracellulære koncentration af cAMP som følge af koleratoksin.
- Beskriv den relevante signaleringsvej fra receptoraktivering til øget kinaseaktivitet.
- Såfremt det trimere Gs-protein får nedsat sin GTPase aktivitet, vil Gα være bundet til GTP i længere tid. Dette resulterer i øget aktivering af adenylyl cyklasen og dermed i en øget intracellulære koncentration af cAMP.
- Aktivering af den Gs protein-koblede receptor leder til en konformationsændring i det tilhørende trimere Gs protein, således at GDP dissocierer fra Gα og GTP bindes i stedet. Dermed dissocierer Gβγ fra Gα og Gα-GTP aktiverer adenylyl cyklasen, som omdanner ATP til cAMP, som sidenhen associeres til og aktiverer protein kinase A (PKA). (Det vil ligeledes være korrekt, såfremt man redegør for at Gα og Gβγ forbliver associeret efter GTP binding).
CFTR fosforyleres i kolera-inficerede epitelceller som funktion af den ændrede GTPase aktvitet, hvorved dens åbningssandsynlighed øges.
- Angiv hvilke(n) aminosyre(r) der forventes at blive fosforyleret.
- Redegør for hvorvidt man grundet den øgede åbningssandsynlighed vil kunne måle en ændret Cl- konduktans (ledningsevne).
- Idet Cl- er negativt ladet, vil der ved en øget åbningssandsynlighed for Cl- kanalen løbe en strøm, og man vil dermed kunne måle en øget konduktans.
- PKA fosforylerer serin og threonin.
Den heraf følgende ændring af den intracellulære Cl- koncentration bidrager til at øge aktiviteten af en symporter på den basolaterale membran, Na+/K+/2Cl- transporteren (NKCC1), som transporterer Cl- ind i cellen.
- Redegør for hvilken type transportmekanisme NKCC1 hører under (herunder for energiforbruget).
Side 3 af 27
- Redegør for hvorvidt den øgede NKCC1 transportaktivitet kan måles som en konduktansændring.
- Redegør for hvorledes Na+, der transporteres ind i cellen af NKCC1, transporteres ud af cellen igen.
- Forklar hvorledes den øgede Cl- transport over tarmepitelet kan bidrage til kolera-induceret diarré.
- NKCC1 er en koblet transporter, der kan transportere en ion imod en elektrokemisk gradient ved hjælp af den energi, der frigives ved, at en anden ion transporteres med sin elektrokemiske gradient. (Dette kaldes sekundær aktiv transport).
- Idet transporten er elektroneutral (1 Na+, 1 K+, 2 Cl-), løber der ikke en strøm, når NKCC1 er aktiv. Dermed kan man ikke bestemme en modstand (R) og ej heller konduktansen (G = 1/R).
- Det Na+, der transporteres ind i cellen via NKCC1 (og andre transportere og kanaler), skal aktivt pumpes ud igen af Na+/K+-ATPasen, idet ionen transporteres imod sin elektrokemiske gradient.
- Med øget Cl- transport fra tarmepitelet ind i tarmlumen, øges osmolariteten i lumen, hvorfor vand vil følge Cl- fluxen som følge af osmose. Derved vil den endelige afføring indeholde større mængde væske (= diarré).
ECB, 4. Udgave, kapitel 12 og 16, øvelse 1.
Hæmopoiese er reguleret af en række transskriptionsregulatorer, som enten hæmmer eller aktiverer transskription af linje-specifikke gener. Transskriptionsfaktoren GATA1 hæmmer erythroide progenitor cellers proliferative potentiale, således at de ikke længere deler sig, men danner hæmoglobin og efter udstødning af nukleus ender som modne erythrocytter.
En forskergruppe har udviklet en erythroid progenitor cellelinje, som ikke udtrykker GATA1, hvilket resulterer i, at cellerne spontant undergår apoptose. For at undgå dette blev cellerne stabilt transfekteret med et plasmid indeholdende Bcl-2 (G1E celler).
- Redegør for intrinsic apoptose (herunder for hvorledes Bcl-2 regulerer cellens overlevelse).
- Ved intrinsic apoptose (igangsat af cellulær stress – i dette tilfælde grundet manglende ekspression af GATA1) danner pro-apoptotiske proteiner fra Bcl-2 familien (Bax og/eller Bak) porer i mitokondriemembranen, hvorefter cytochrom c diffunderer ud i cytosolen. Cytochrom c vil binde til adaptor proteiner (apaf-1) og pro-caspase-9 i cytosolen og derved danne et apoptosom. Herved kløves og aktiveres pro-caspase-9, som er en initiator caspase. Aktivt caspase-9 vil efterfølgende kløve pro-caspase-3, hvilket resulterer i en stigende mængde af aktivt caspase-3. Bcl-2 kan modvirke poredannelsen i mitokondriet, og dermed forhindre at cellen undergår apoptose, ved at binde til de pro-apoptotiske Bcl-2 proteiner (cellen overlever). ECB, 4. udgave, kapitel 18 samt sau 25 materiale.
G1E celler blev yderligere transfekteret med et plasmid kodende for et rekombinant protein bestående af GATA1 fusioneret med den ligandbindende del af en østrogenreceptor (G1E-ER celler). Tilsætning af østrogen i dyrkningsmediet til G1E-ER cellerne resulterer i, at østrogen bindes til det rekombinante GATA1 protein, som derved aktiveres.
- Redegør for signaleringsvejen fra østrogen tilsætning til G1E-ER celler til aktivering af det rekombinante GATA1 protein.
- Da østrogen er et mindre hydrofobt molekyle, vil det (fra blodbanen) kunne diffundere over plasmamembranen og videre over kernemembranen. I de genmodificerede G1E-ER celler vil østrogen binde til det rekombinante GATA1 protein (bestående af den ligandbindende del af østrogenreceptoren og GATA1) og aktivere dette. ECB, 4. udgave, kapitel 12 og 16.
- Angiv tre andre signalstoffer som signalerer via samme type receptorer som østrogen.
G1E celler blev yderligere transfekteret med et plasmid kodende for et rekombinant protein bestående af GATA1 fusioneret med den ligandbindende del af en østrogenreceptor (G1E-ER celler). Tilsætning af østrogen i dyrkningsmediet til G1E-ER cellerne resulterer i, at østrogen bindes til det rekombinante GATA1 protein, som derved aktiveres.
- Testosteron, kortisol, tyroxiner m.m.. ECB, 4. udgave, kapitel 16.
Det blev undersøgt hvorvidt GATA1 hæmmer proliferation (celledeling) via regulering af ekspressionen af den cyklin afhængige kinase inhibitor (CKI) p27 (figur 1).
Figur 1: Makromolekyler oprenset fra østrogen stimulerede G1E-ER celler analyseret ved northern blot (A) og SDS-PAGE efterfulgt af western blot (B). 28S ribosomal RNA er anvendt som loading kontrol i (A). 28S båndene er hvide frem for sorte, idet der er brugt en anden type detektionsteknik. Modificeret fra Rylski et al., Mol. Cell. Biol., vol. 23, 2003.
- Redegør for resultaterne i figur 1 (svaret skal inkludere en mulig loading kontrol for (B)).
- Angiv 5 måder hvorpå en celle kan regulere ekspression af et gen.
- Redegør for hvorledes GATA1 via regulering af p27 ekspression (figur 1) må formodes at regulere G1E-ER proliferation.
- Figur 1A: p27 mRNA i østrogen stimulerede G1E-ER celler analyseret ved northern blot. Resultatet viser, at der ikke kan måles p27 mRNA i ustimulerede celler, mens mængden af p27 mRNA stiger, når cellerne stimuleres med østrogen, til et plateau efter ca. 18 timer. Årsagen til dette kan være, at østrogen via det rekombinante GATA1 protein stimulerer p27 transskription (eller at p27 mRNA stabiliseres). Ribosomalt 28S fungerer som loading kontrol og viser, at der tilsyneladende er loadet mindre RNA i de sidste brønde. Figur 1B: p27 protein i østrogen stimulerede G1E-ER celler analyseret ved western blot. Resultatet viser, at p27 protein ikke kan detekteres i ustimulerede celler, hvilket er i overensstemmelse med northern blottet. Mængden af p27 protein stiger, når cellerne stimuleres med østrogen til et plateau efter ca. 24 timer. Årsagen til dette er sandsynligvis den øgede mængde p27 mRNA (men det kan ikke udelukkes at andre regulatoriske mekanismer er involveret). En mulig loadingkontrol kunne være aktin, idet ekspressionen af aktin forventes at være uafhængig af stimulationen. ECB, 4. udgave, kapitel 4, kapitel 10, SAU 1 og SAU 16 materiale, metodeoversigt.
- 1) Transskription, 2) RNA processering, 3) regulering af mRNA transport og lokalisering, 4) regulering af mRNA nedbrydning, 5) regulering af translation (regulering af protein nedbrydning og regulering af protein aktivitetskontrol vil ligeledes være korrekte svarmuligheder). ECB, 4. udgave, figur 8-3.
- p27 hæmmer cyklin afhængige kinaser (S-Cdk), således at cellen ikke kan træde ind i S-fasen. GATA1 stimuleret p27 ekspression vil således hæmme proliferation, idet cellen gør holdt i G1 fasen. ECB, 4. udgave, kapitel 18.
Downs syndrom er forårsaget af tilstedeværelsen af et ekstra kromosom 21 i zygoten. Børn med Downs syndrom har højere risiko for at udvikle akut megakaryoblastisk leukæmi (AMKL). Næsten alle Downs syndrom patienter med AMKL har somatiske mutationer i genet, som koder for transskriptionsfaktoren GATA1. Det er vist, at GATA1 mutationer øger Akt aktiviteten i megakaryoblaster.
- Redegør, gerne ved hjælp af skitse, for hvorledes aneuploide gameter kan opstå.
- Redegør, gerne ved hjælp af skitse, for hvorledes Akt aktiveres i normale (ikke aneuploide) celler.
- Redegør, ud fra den ændrede Akt aktivitet, for et cancer karakteristika (Hallmark) som må forventes påvirket i megakaryoblaster hos patienter med AMLK.
- Hvis adskillelsen af kromosomerne i meiose I eller II ikke forløber korrekt betegnes det nondisjunction. Ved Down syndrom er årsagen tilstedeværelsen af et ekstra kromosom 21 i zygoten. Dette vil kunne ske, hvis det maternale og paternale kromosompar ikke adskilles i meiose I, og resultatet derfor bliver to gameter med to kromosom 21, og to gameter, der helt mangler kromosom 21 efter anden meiotiske deling (eller en oocyt med to kromosom 21, hvis der tages udgangspunkt i meiose hos kvinden). Nondisjunction kan ligeledes foregå under den anden meiotiske deling, hvis søsterkromatiderne ikke adskilles korrekt resulterende i en gamet med to kromosom 21, en gamet med nul kromosom 21 og to gameter med et kromosom 21 (eller en oocyt med to kromosom 21, hvis der tages udgangspunkt i meiose hos kvinden). ECB, 4, udgave, kapitel 19.
- Ligandbinding til to receptor tyrosin kinase monomere får disse til at dimerisere, hvorefter kinasedomæner i receptoren krydsfosforylerer specikke tyrosiner på den intracellulære del af receptoren. PI-3kinasen bindes til fosforyleret tyrosin og fosforylerer derefter PIP2 til PIP3. PK1 og Akt associeres til PIP3 molekyler, hvorefter PK1 og PK2 (i cytosolen) fosforylerer Akt. Denne
fosforylering leder til en konformationsændring af Akt, som nu bliver aktivt og kan dissociere fra PIP3. ECB, 4. udgave, kapitel 16.
- Mutationer i GATA1, som fører til øget Akt aktivitet, må forventes at beskytte megakaryoblaster mod apoptose (cancer hallmark), idet aktivt Akt bl.a. vil fosforylere Bad, hvorefter Bcl-2 vil dissociere fra Bad og efterfølgende hæmme intrinsic apoptose (som beskrevet i svaret til spørgsmål 1). ECB., 4. udgave, kapitel 16 og 20. (En redegørelse for at Akt stimulerer mTOR-reguleret cellevækst har betydning for celledeling, et andet Hallmark (”sustained proliferative signaling”), vil ligeledes blive betragtet som et fyldestgørende svar.
GATA1 er en potentiel markør for udvikling af AMKL, men mutationer i GATA1 alene er ikke nok til udvikling af AMKL.
- Forklar hvorfor mutationer i GATA1 alene ikke resulterer i AMKL.
- Carcinogenese, gradvis ændring af en normal celle til en kræftcelle med typiske cancer karakteristika (Hallmarks), kræver mutationer i mere end et enkelt gen og mutationerne skal forekomme i specifikke gener – enten proto-onkogener eller tumor suppressor gener. Mutationer i GATA1 alene vil derfor ikke resultere i AMKL. ECB, 4. udgave, kapitel 20.
