Morfologisk metodik 3 - Immunohistokemi Flashcards
Antigen
En, för organismen, främmande molekyl som framkallar en reaktion hos immunförsvaret. Reaktionen leder till nybildning av antikroppar
Epitop
Den del av antigen dit en specifik antikropp binder. Binder med en kort aminosyrasekvens
Antikropp
Glykoprotein (makromolekyl besående av protein och kolhydrat) som produceras i en organism vid antigenstimulering.
Har stor specificitet till det stimulerande antigenet
Vilka fem klasser finns av antikroppar?
IgA, IgD, IgE, IgG & IgM
Generell uppbyggnad, antikropp
Två lätta och två tunga proteinkedjor, sammanlänkade med disulfidbryggor, bildar tillsammans en Y-formig molekyl.
Fab-domän
Topparna på “y’et”, bestående av en tung och en lätt kedja. Dessa är hypervariabla, och bildar antigen-bindande regioner (Fab-regioner)
Fc- region
I antikroppens svans. Kan binda till komplementära komponenter, och/eller receptorer på cellytan
Polyklonala antikroppar
Härstammar från flera cell-linjer-> heterogen samling (=flera olika antikroppar) riktade mot flera olika epitoper
Monoklonala antikroppar
Härstammar från en enda cell-linje-> identiska antikroppar riktade mot en epitop.
Hur produceras antikroppar?
B-lymfocyter har membranbundna antikroppar bundna till sin yta. Då ett främmande antigen binder in till en B-cell som har antikropp som passar antigenet på sin yta differentierar denna till plasmacell, som producerar fler av samma antikropp som utsöndras.
Hur binder antikroppen till antigen?
Antikroppens binding-site känner igen en epitop på antigenet, och binder sig dit mha Van der Waal’s krafter, vätebindningar, elektrostatiska interaktioner och hydrofobiska krafter
Vad menas med affinitet?
Affinitet innebär styrkan i reaktionen mellan en antigen-epitop och en antikropp, och det styrs av hur väl antigenets epitoper formmässigt passar in i antikroppens binding-site
Vad menas med aviditet?
Sammanlagda styrkan mellan en antikropps binding-site och ett antigen, vilket beror på hur många binding-sites på en antikropp som binder till samma typ av epitop. Aviditeten är beroende av den sammanlagda affiniteten mellan en binding site och epitopen
Vad menas med specificitet när man pratar om antikropp-antigen-bindning?
En enskild antikropps förmåga att binda till endast en specifik antigen-epitop
Vad menas med korsreaktion när man pratar om antikropp-antigen-bindning?
En enskild antikropps förmåga att binda till fler än en antigen-epitop, eller en epitop som inte passar perfekt
Specifik inbindning
Bindning mellan antikropp och antigen till avsedd epitop
Ospecifik inbindning
Bindning beror ej på anitkropp-antigen-reaktion, och vill undvikas. Exempel: Endogent peroxidas/fosfatas, endogent biotin
Hur förhindras ospecifk inbindning till endogent peroxidas?
Mha väteperoxid
Hur förhindras ospecifk inbindning till endogent biotin?
Mha avidin och biotinlösning
Vad står ELISA för?
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ELISA, princip
Antigen binder till brunnarnas väggar. Prov tillsätts. Provets antikroppar reagerar med brunnarnas antigen
När används ELISA?
När man vill kvantifiera och detektera en antikropp eller ett antigen
Vad står FACS för?
Flourescence Activated Cell Sorting
FACS, princip
Celler i lösning märks med flourescerande antikroppar (och får en laddning). Cellerna passerar en laser -> separation utifrån storlek och grunlighet
Flourescensen mäts. Mängden ljus motsvarar mängden celler av en viss typ (olika celler sänder ut olika flourescensmönster).
Cellerna passerar laddade plattor och sorteras utifrån sin laddning
Direkt metod
Man använder sig av en antikropp, som är konjugerad med t.ex. ett enzym
Indirekt metod
Man använder sig av flera antikroppar, som man bygger en kedja av. Om t.ex. primära antikroppen är musantikropp, är den sekundära anti-musantikropp.
Hur namnges metoder?
- Efter det enzym-immuno-komplex som användes
PAP = Peoxidas anti-peroxidas
APAAP = alkalisk fosfatas anti-alkalis fosfatas - Efter molekyler bundna till biotin
ABC = Avidin/steptavidin-biotin-enzym-komplex
LAB/SLAB = Labelled avidin/laballed streptavidin-biotin
CSA = en ABC-metod + Catalyzed signal-amplification
Envision = Dextranpolymer som de sekundära antikropparna är fästa vid
Vad händer med resultatet om antikroppen binder till fel eller flera olika epitoper?
Det skulle ge ett falskt positivt analyssvar.
Vad händer med resultatet det förekommer antikropp-bindande endogena komponenter?
Det skulle ge ett falskt positivt analyssvar.
Exempel på vad som skulle ett falskt negativt analyssvar? (5)
- Prepareringen har förstört epitoperna (t.ex. snitt har torkat)
- Maskerade epitoper
- Glömt antikropparna/för svag antikropps-koncentration
- Paraffin kvar på snittet
Gamla lösningar
Hur kan maskerade epitoper uppkomma, och hur undviker man dem?
Maskerade epitoper kan uppkomma vid gelerande fixering. Dessa undviks genom att man tillsätter en retrieval buffer.
