Morfologisk metodik 2 - infärgning

Question 1

Skillnad på översiktsfärgning och specialfärgning

Answer 1

Översiktsfärgning - 2 färger. Visar cellkärna kontra cytoplasma
Specialfärgning - ger en mer detaljerad bild av vävnadens uppbyggnad t.ex. bindväv, elastiska fibrer, viruspartiklar, svamp)

Question 2

Vilka två grupper av färgmolekyler finns?

Answer 2

• Naturliga färgämnen: hämtade ur naturen, processade och renframställda
• Syntetiska färgämnen: framställda ur stenkolstjära

Question 3

Exempel på naturliga färgämnen (3)

Answer 3

• Hematoxylin - trädbark från Kampeschträd
• Saffranin - från krokus
• Karmin - från sköldlus

Question 4

Vad i färgämnet färgar vävnadssnittet?

Answer 4

Färgämnets joner, som har färgande egenskaper. I de flesta fall har jonerna motsatt laddning till komponenten som den färgar

Question 5

Vad beror färgmolekylens affinitet till vävnaden på? (3)

Answer 5

• Reaktiva grupper hos färgmolekyl och vävnad
• Diffusionshastighet hos färgmolekylen
• Permeabilitet hos vävnad

Question 6

Vad beror diffusionshastigheten hos färgmolekylen på? (5)

Answer 6

• Molekyl-/aggregat-storlek
• Lösningsmedel
• Koncentration
• pH
• Temperatur

Question 7

På vilket sätt påverkar ett vävnadsnätverks storlek färgningen?

Answer 7

Vid fixering bildas ett nätverk mellan proteinerna. Beroende på storlek på nätverket påverkar det vilken storlek av molekyler som färgar in:

• Erytrocyter bildar täta nätverk med små porer
• > färgas av små molekyler
• Muskeltrådar bildar glesare nätverk, med större porer -> färgas av större molekyler
• Kollagen bildar glesast nätverk, med ännu större porer
• > färgas av stora molekyler

Question 8

På vilka fyra sätt kan man dela in färgämnen?

Answer 8

• Efter sättet att binda till vävnaden
• Hur färgämnet fäster till vävnaden
• Hur färgämnet får rätt styrka
• Hur de olika färgerna anbringas till vävnaden

Question 9

Indelning “efter sättet att binda till vävnaden” har fyra kategorier, vilka?

Answer 9

• Katjonfärgämnen
• Anjonfärgämnen
• Amfortera färgämnen
• Indifferenta färgämnen

Question 10

Vad menas med katjonfärgämnen? Vad färgar de, + exempel? Exempel på katjonfärgämnen.

Answer 10

• Basiska färgämnen (har +laddning)
• Färgar sura vävnadskomponenter, som t.ex. proteiner med karboxylgrupper, cellkärnor, bakterier, brosk, slem och nerver
• Exempel på katjonfärgämnen: metylgrönt, metylenblått, toluidinblått

Question 11

Vad menas med anjonfärgämnen? Vad färgar de, + exempel? Exempel på katjonfärgämnen.

Answer 11

• Sura färgämnen (har -laddning)
• Färgar basiska vävnadskomponenter, som t.ex. proteiner med fria aminogrupper, cytoplasma, muskler, kollagen, bindväv och erytrocyter
• Exempel på anjonfärgämnen: Eorin, pikrinsyra, anilinblå

Question 12

Vad menas med amfortera färgämnen? Vad färgar de, + exempel? Exempel på katjonfärgämnen.

Answer 12

• Är neutrala (har både + och - laddning)
• Används som indikatorfärgämne, färgar blodkroppar och parasiter
• Exempel: mest känt är en kombination av metylenblått (eller azur) och eosin

Question 13

Vad menas med indifferenta färgämnen? Vad färgar de, + exempel? Exempel på katjonfärgämnen.

Answer 13

• Har varken + eller - laddning. Färgningen beror på löslighet hos ämnet, och de löser sig direkt i cell- eller vävnadsbeståndsdelarna.
• Färgar fettsubstanser
• Exempel: Sudan III & IV, Oil red

Question 14

Indelningen “Hur färgämnet fäster till vävnaden” Delas in i tre subgrupper, vilka? Vad menas med de olika?

Answer 14

• Direkta/substantiva metoder: färglösningen behöver inga tillsatser
• Reducerande/oxiderande metoder: medel behövs innan färglösning
• Indirekta/adjektiva metoder: ett betmedel som förmedlande länk krävs mellan färgmolekyl och vävnad för att färgmedlet ska fästa. Betmedlet läggs antingen i innan färglösningen, eller blandas med färglösningen

Question 15

Vad är definitionen av ett äkta betmedel?

Answer 15

En polyvalent metalljon, som bildar komplex med vissa färgämnen, genom kovalent bindning

Question 16

Betmedel Mayer’s Hematoxylin

Answer 16

Aluminium

Question 17

Betmedel Weigert’s Hematoxylin

Answer 17

Järn

Question 18

Betmedel Harris’ Hematoxylin

Answer 18

Aluminium

Question 19

Vilka två underkategorier finns vid indelningen “Hur färgämnet får rätt styrka”, och vad innebär de?

Answer 19

• Progressiv metod: färgningen avbryts då bästa optimala färgnyansen erhållits
• Regressiv metod: överfärgning. Överskottet av färg löses bort (differentierar) tills optimal färgnyans erhålles

Question 20

Vad kan man ta hjälp av för att överskott av färg ska differentiera vid användning av regressiv färgmetod? (5)

Answer 20

• Syror
• Alkohol
• Saltsur alkohol
• Metallsaltlösningar
• Kranvatten

Question 21

Hur delas indelningen “hur de olika färgerna anbringas till vävnaden” in, och vad innebär de olika? (2)

Answer 21

• Succedanfärgning: flera olika färglösningar efter varandra

- Simultanfärglösning: en färgblandning av två eller flera färgsubstanser i samma färglösning

Question 22

Hur förlänger färglösningars hållbarhet? (5)

Answer 22

• Använd arbetslösning (som spädes) och låt stamlösningen stå ospädd
• A- & B-lösning förvaras skilda
• Filtrera tillbaka
• Ev. konserveringsmedel
• Mörk flaska i kylskåp

Question 23

Vad används för att späda färglösningar?

Answer 23

Destillerat vatten eller alkohol (olika koncentrationer)

Question 24

Vilken koncentration har ett färgämne vanligtvis?

Answer 24

0,1-2,0%

Question 25

Bokstavskodning, färgämnen (8)

Answer 25

• B = blåaktig
• C = kloräkta (tål klor)
• G = grönaktig
• Y = gulaktig
• L = ljusäkta (tål ljus)
• M = blandning
• S = lättlöslig/spritlöslig
• W = vattenlöslig

Question 26

På vilka tre sätt kan färgämnen få sitt namn?

Answer 26

• Kemiska namn (information om kemisk sammansättning)
• Fantasinamn
• Fabriksnamn (vanligast): Patenterade namn

Question 27

Ett färgämnes tre kemiska delar

Answer 27

• Kromofor grupp
• Auxokrom grupp
• Kromogen

Question 28

Vad gör de kromofora grupperna? Exempel

Answer 28

• Är färgbärande, och har ingen affinitet till vävnad
• Omättad grupp som absorberar ljus (elektron som lätt exciteras)
• Grupper av atomer som får färgämnet att absorbera ljus i UV eller synliga området av spektrat
• Flera kromofora grupper krävs för absorption i det synliga området
• Exempel: -N=N- (azo), -N=O (nitroso), -NO2 (nitro), >C=C< (alken, aromat), >C=O (oxo)

Question 29

Vad gör de auxokroma grupperna? Exempel

Answer 29

• Är färgbindande (har affinitet till vävnad, via + och - laddningar)
• Absorberas ej själv ljus
• Binder till kromofort system
• Ändrar ljusabsorptionen mot längre våglängd (=ger ökad färgintensitet)
• Finns både basiskt och surt auxokrom, som färgar sur resp. basisk vävnad
• Finns amfortera färgämnen
• Exempel: -OH (hydroxyl), -NH2 (amino), -SH (mercapto)

Question 30

Vad gör den kromogena delen?

Answer 30

Den kromogena delen är de kromofora grupperna och bensenderivatet

Question 31

Varför är färgningstider så viktiga vid trikromfärgningar?

Answer 31

Vid trikromfärgning har färgmolekylerna affinitet till samma basiska protein. Färgningen bygger på att olika stora molekyler har olika permeabilitet hos vävnad. Små molekyler färgas först, och de större tar längre tid. Håller man då inte tiderna kommer de stora molekylerna täcka över de små, och resultatet kommer då vara felaktigt

Question 32

Vad gör kromsyran vid grokott-färgning?

Answer 32

Kromsyran oxiderar polysackariderna i svamparnas cellvägg och aldehyd bildas

Question 33

Vad har aldehyder för roll vid grokott-färgning?

Answer 33

Vid tillsättning av metenamin-silver-lösningen reagerar silverjonerna med aldehydgrupperna. Silverjonerna reduceras och fälls ut som metalliskt silver (Impregnering)

Question 34

Vad gör natriumbisulfit vid grokott-färgning?

Answer 34

Bleker -> tar bort “brunstensfällningen” som bildas vid kromsyran

Question 35

Vad har guldklorid för roll vid grokott-färgning?

Answer 35

Toning. Guldklorid har en konserverande effekt på silverfärgningen, som blir mörkare och kan bevaras längre

Question 36

Vad gör natriumtiosulfat vid grokott-färgning?

Answer 36

Fixering. Ökar stabiliteten på metallutfällningen

Question 37

Vad är viktigt att tänka på vid grokott-färgning? (7)

Answer 37

• Rena kemikalier - p.a.-kvalitet
• Rena utensilier
• Inga metallpincetter
• Tid i kromsyran
• Tid och temperatur vid silverimpregnering
• Sköljningsstegen
• Snittjocklek

Question 38

Vid en översiktfärgning enligt Hematoxylin-Eosin var kärnfärgningen korrekt, men cytoplasmafärgningen alldeles för svag. Vad kan ha orsakat detta?

Answer 38

Felet kan ha uppkommit genom att preparatet legat för länge i vatten eller 70% alkohol, eller om det är för mycket vatten kvar i preparatet. Man kan även ha droppat för lite/glömt droppa i ättiksyra. Även en felaktig spädning kan ge liknande resultat.

Question 39

Vid en översiktsfärgning enligt Hematoxylin van Gieson hade delar av preparatet fallit bort. Vad kan ha orsakat detta?

Answer 39

Både för lång och för kort tid i ugnen kan orsaka bortfall av preparatet. Även fel temperatur i ugnen skulle kunna ge detta fel. Om provet har dehydrerats för länge skulle även det kunna ge bortfall. En annan möjlighet är att preparatet har spruckit, och då troligtvis för att snittningsartefakter uppstått. Exempel på detta är luftbubbla i paraffinet.

Question 40

Vid en trikromfärgning enligt Masson låg det en mjölkig hinna på glasen, vilket gjorde den mikroskopiska bilden oklar. Vad kan ha orsakat detta, och kan felet åtgärdas.

Answer 40

Det kan bero på att man inte dehydrerat tillräckligt länge, vilket skulle medför att både alkohol och vatten kan finnas kvar i snittet.
Felet kan åtgärdas. Man kan rehydrera och dehydrera igen. Eftersom monteringsmedlet är lösligt i xylen kommer det lossna när man sätter ner preparatet i xylen.

Question 41

Vid en trikromfärgning enligt Masson hade vävnadens muskeltrådar och erytrocyter en blåaktig ton. Vad kan ha orsakat detta, och kan felet åtgärdas?

Answer 41

De små molekylerna färgas först, då det tar längre tid för de stora att penetrera. Om man då inte håller tiderna hinner de större molekylerna färga in, och då syns enbart den mörka färgen från de stora molekylerna. Detta fel kan inte åtgärdas. Istället måste man göra om färgningen med nytt snitt

Question 42

Vid en svampfärgning enligt Grokott blev både den positiva kontrollen och provet negativt. Vad kan ha orsakat detta, och kan felet åtgärdas?
Kan man lita på att provet är negativt? Varför/Varför inte?

Answer 42

Detta fel innebär att färgningen inte har satt sig och att svamparna inte har blivit färgade. Mest troligt är att det har blivit fel i oxidation-reduceringssteg, eller att något av stegen har glömts. Om kromsyran har glömts har inte aldehyder kunnat bildas, vilket innebär att silverjonerna inte kunnat bilda metalliskt silver. Ett annat möjligt fel är att preparatet inte varit länge nog i ugnen (med silverlösningen), eller att temperaturen var felaktig.
I grokott-färgning går det inte att backa, vilket innebär att det krävs ett nytt snitt. Viktigt då att man först kontrollerar temperatur på ugnen, och att utensilierna inte är gjorda av metall.
Eftersom det positiva kontrollglaset är negativt går resultatet inte att lita på.