Mikroskopi Flashcards
Vad menas med fasförskjutning, och när sker det?
Om ljusabsorptionen är för låg för att det ska bli tillräckliga amplitudförändringar för en synlig färgförändring sker en fasförskjutning. Den kan inte ses, men den innehåller ändå mycket information
På vilka fyra sätt påverkas ljus när det passerar optik eller annat material?
Reflektion, Refraktion, Diffraktion & Dispersion
Reflektion
Är en abrupt ändring av riktningen för en vågfront på en yta mellan två olika media, så att vågfronten går tillbaka i det mediet den kom från, som i en spegel
Refraktion
Ljusstrålars brytning vid övergången mellan två ämnen med olika brytningsindex -> ljuset ändrar hastighet
Vad är brytningsindex?
Även kallat refraktionsindex. Är ett mått på ljusets hastighet genom ämnet
Diffraktion
Ljus böjer av och breder ut sig då det kommer till ett hinder eller en öppning. Hur mycket ljuset böjer av och breder ut sig beror på våglängd och storlek på hindret
Dispersion
Ljus bryts upp i sina färgsbeståndsdelar när vitt ljus går genom en prisma, dvs man får ett spektrum.
Vilka typer av strålgång finns och hur fungerar de?
- Transmitterande strålgång - ljuset går genom hela provet, från lampa till okular. Som i ett vanligt ljusmikroskop
- Reflekterande strålgång - ljuset reflekteras eller emitteras från provet. Går via en speciell typ av spegel
Mikroskopstekniker (7 st)
Ljusfält, mörkfält, faskontrast, DIC (Differential interference contrast), polarisation & fluorescence
Ljusfältsmikroskopi
- Enklaste tekniken
- Ljuskälla och köhlerinställd kondensor behövs
- Valfritt objektiv med valfri förstoring
- Dålig kontrast i transparenta preparat
- Kräver färgning av preparat
- Färgning av döda preparat
Mörkfältsmikroskopi
- Kontrast skapas i transparanta och ofärgade preparat, som då framträder ljust mot en svart bakgrund -> ökar kontrast och ger en 3D-känsla
- Disk blockerar ljuset och skapar en ringformad ljuskon. Preparatet träffas av ljus från sidorna
Faskontrastmikroskopi
- Olika strukturer “saktar ner” vissa ljusvågor -> ljusvågorna kommer ur fas
- Fasförskjutna strukturer kommer framträda som ljusa, resp. mörka, och bakgrunden kommer förbli grå
DIC-mikroskopi
- Polariserat ljus splittas upp så att det passerar preparatet strax intill varandra. Tjocka delar orsakar fasskifte mellan ljusvågorna
Fluorescencemikroskopi
- Ljus av olika våglängder ses som olika färger
- Fluorokrom = molekyl som avger ljus av en specifik våglängd
- Reflekterad strålgång
- Olika fluorokromers excitation- och emissions-spektra kan överlappa varandra
Vad är N.A?
Numerisk apertur. Förmågan att fånga upp ljus och synliggöra små detaljer vid ett givet W.D (work distance). Hög N.A = Hög upplösning.
Upplösning, definition
Det minsta avståndet där vi kan urskilja två punkter som separata
Kromatisk aberation
ljus av olika våglängder (dvs olika färger) bryts av olika mycket när det passerar genom en glasprisma.
Sfärisk aberation
ljus som bryts i kanten av linsen fokuseras inte i samma fokalpunkt som ljus som passeras genom linsens centrum.
Kan minskas genom användning av aperturbländaren, för att avskärma de perifera strålarna
Astigmatism
Cirkulära strukturer avbildas som oskarpa och ovala.
Undviks mha stigmatorer (=elektriska eller magnetiska fält)
Funktion, aperturbländare
Reglera upplösning, kontrast och färgnyans
Funktion, ljusfältsbländare
Reglera hur mycket av synfältet som ska belysas
Funktion, kondensor
Fokusera ljuset på preparatet
Vad står SEM för?
Svepelektronmikroskop
Vad står TEM för?
Transmissionselektronmikroskop
TEM
- Genomstrålning av tunna objekt
- Visar detaljerad bild av celler och dess organeller
- Ger en 2D-bild
- Oftast tunna snitt
Fixering, TEM
- Fysikalisk - frysning(kryo) eller mikrovågsbehandling
- Kemisk - medel med lämplig jonsammansättning & osmolaritet, och förmåga att bibehålla konstant pH-värde.
Vid kemisk fixering görs ofta dubbelfixering: - Primärfixering - formaldehyd eller glutaraldehyd, eller en kombination av båda
Postfixering - osmiumtetroxid
Dehydrering, TEM
Organiska lösningsmedel i stigande koncentration (t.ex. etanol, metanol, aceton)
Inbäddning, TEM
Härdplast. Antingen epoxyplast eller akrylatplast.
För- och nackdel, epoxyplast
Fördel: krymper vävnaden enbart med 2%, jämn polymerisering, stabil i e-strålen
Nackdel: hydrofob, högviskös, polymeriserar i värme (60C)
För- och nackdel, akrylplast
Fördel: hydrofil, lågviskös, polymeriserar både i rumstemp och i - grader
Nackdel: krymper vävnaden 10-20%, ojämn polymerisering, mindre stabil i e-strålen
Krav på plasten som används vid inbäddning av TEM-preparat (5)
- Låg viskositet
- Uniform polymerisering (härdning)
- Ingen volymförändring
- Lämplig hårdhet
- Stabil och jämn kvalitet
Snittning, TEM (4)
- Intsrument: ultramikrotom (ultrotom)
- Kniv: glas eller diamant
- Triming: till formen av en trapetsoid (platt pyramid)
- Snittningstjocklek: 60-70 nm
SEM
- Används för att studera objekts topografi (ger 3D-bild)
Varför måste preparatet vara torrt vid arbete med SEM?
För att mikroskopet arbetar i högvakuum
Hur fixeras SEM-preparat?
Dubbelfixering.
Primärfixering: aldehydfixering
Postfixering: enligt OTOTO-metod, dvs. upprepad osmifiering
Dehydrering, SEM
Stigande koncentrationer av etanol
Vad menas med konduktiv montering (SEM)?
Preparatet sitter fast på metall (jordat). Om inte kan man få överslag i mikroskopet
