Molekularbiologie Flashcards
Was können wir mit den Methoden der Molekularen Klonierung machen?
- DNA und RNA isolieren
- gezielt vervielfältigen
- Fragmente ausschneiden und einfügen
- DNA Sequenzen gezielt verändern (mutieren) und ihre Basenfolge untersuchen (sequenzieren)
- die von codierten Genen codierten Proteine exprimieren (transcribieren und translatieren)
Was ist der Begriff für Molekulares Klonieren?
Einbringen eines gewünschten Gen in ein kleines, gut manipulierbares genetisches Element, den Vektor
Was ist ‘‘Vektor’’?
DNA-Molekül mit Sequenzen, die die eingene Vervielfältigung (Replikation) ermöglichen und die ‘‘Fremd-DNA’’ aufnehmen kann
Rekombinante DNA
Molekül, das DNA verschiedener Herkunft enthält
Was können als Klonierungsvektoren verwendet werden?
-Plasmide
-Bakteriophage
Eigenschaften vom Plamid als Klonierungsverktor
-auto selbst-replizierende DNA, enthält zusätzliche genetische Information, codieren zB: Resistenzen gegen Antibiotika
-besitzt eigenen Replikationsursprung (ori), besteht meistens aus zirkulärer, dsDNA, selten linear und selten aus RNA
-liegt intrazellulär in einfacher Kopie oder höherer Kopienzahl
-können sich nur intrazellulär vermehren, meistens in Bakterien oder Hefe, Pilzen
Welche Bakteriophagen können als Klonierungsvektoren verwendet werden?
-Lambda: dsDNA, kann DNA bis zu 20kb aufnehmen
-M13: ssDNA, doppelsträngige replikative Form kann isoliert und wie Plasmid verwendet werden
Was bedeutet imkompatible Plasmide?
-Plasmide aus einer Familie haben gleiche Replikationsgene
- 2 Plasmide aus einer Familie können in Zelle nicht koexistieren-inkompatible
Warum können Plasmide aus einer Familie nicht in Zelle coexistieren?
-Konkurrenz um eine Membranbindungsstelle des Replikationsursprungs
-Ein Gen nahe des ori codiert eine RNA, die komplementär zur Primer-RNA des zweiten Plasmids ist und dessen ori durch Hybridisierung inaktiviert
Wie repliziert Plasmid?
-die meisten replizieren wie bakterielle Chromosomen
-Manche Plasmide replizieren (wie einige Viren) nach dem Mechanismus der ‘‘RCA’‘-Rolling circle amplification
Mechanismus des RCA
-Ein Strang der ds DNA wird durch eine Endonuklease an einer spezifischen Sequenz geschnitten –> Ein Strang mit freiem 3’- und 5’-Ende
-3’-OH des geschnittenen Strangs wird von DNA-Polymerase als Primer genutzt –> Nukleotide mit 5’-Triphosphat weiter an 3’-OH verbunden
–> ungeschnittener DNA-Strang repliziert –> Rollen –> Einzelstrangbruch wird zum Doppelstrang
Warum werden Plasmide von Zellen repliziert?
Weil Plasmide für Zellen nützliche Gene codieren, wie:
-Resistenzen (zB: gegen Antibiotika wie beta-Lactam, Chloramphenicol)
-Aggression und Virulenz
-Stoffwechselwege
Erforderungen für die Klonierung der DNA
-das Herausschneiden eines Gens oder Genfragments von Interesse
-das Verbinden des Gens oder Genfragments mit einem Vektor
-Möglichkeit zur Nutzung oder Manipulation der isolierten genetischen Infomation
Spezifische Werkzeuge für Klonierung von DNA
Nukleasen, Restriktionsenzyme
Ligase
Restriktionsenzyme
-schneiden innerhalb DNA-Sequenzen
-erkennen palindromische Sequenzen aus 4,6 oder 8 Basenpaaren
-sind eng verknüpft mit Methylierungsenzymen
Was macht Ligase? Für welche Bindungsstelle ist sie effizient?
-erkennt ‘‘nicks’’, katalysiert die kovalente Verknüpfung der freien Ende unter Verbrauch von ATP
-Vorraussetzung: 3’-OH und 5’-Phosphat
-effizient für sticky ends
-Ligase des Bakteriophage T4 verbindet auch blunt ends
4 Schritte für das Einfügen von Genen in Vektoren
- Vektor und Insert werden so geschnitten, dass kompatible sticky ends entstehen (idR mit gleichen Restriktionsenzymen)
- Die geschnittene Fragmente werden gemischt
- sticky ends hybridisieren
- Ligase verknüpft das Rückgrat der DNA
Mögliche Probleme bei der Klonierung von Genen und Lösung
Probleme:
-Vektor hat mehr als eine Erkennungsstelle für das verwendete Restriktionsenzym
-Insertion erfolgt innerhalb wichtiger Gene
Lösung: Polylinker (multiple cloning site)
2 Arten von Transformation bei der Klonierung?
Um DNA in Bakterienzelle einzuführen
1.Chemische Transformation: Vorbehandlung mit CaCl2, Aufnahme der DNA nach Hitzeschock
2.Elektroporation: Vorbehandlung der Zellen durch waschen mit salzarmen/salzfreien Lösungen, Aufnahme der DNA nach Spannungspuls
Indentifikation rekombinanter Vektoren
-Nachweis des Plasmids aufgrund der Resistenz
-Nachweis von Insertion
1. Vermehrung von Klonen (einzeln), Plasmidisolierung, Restriktionsverdau
2. PCR
3. Verwendung zweier Resistenzmarker (Insertionsinaktivierung eines der beiden Gene)
4. Farbreaktion, zB: Blau-Weiss-Screening
Identifikationstechnik: Blau-Weiss-Screening
Plasmide, die an MCS das Gen für die beta-Galactosidase (lacZ) tragen
Nach Insertion eines DNA-Fragments in MCS –> inaktive Galactosidase –> Bakterien, die erfolgreich rekombinante Vektoren enthalten –> weiße Kolonien
>< eine beta-Galactosidase gebildet –> keine rekombinante Vektoren aufweisen –> blau
Wofür braucht man Molekulare Methode der Mutagenese von Genen?
zur Veränderung in der DNA Sequenzen von Genen
Ortspezifische Mutagenese
+Oligonukleotid (Primer) mit gewünschter Mutation, dann verlängert mit DNA-Polymerase
+Plasmid, das aus einem methylierenden Stamm isoliert wurde (Verdau der nicht-mutierten Eltern-DNA durch Methylierungsspezifische Nuklease)
Cassettenmutagenese
Synthetische DNA-Cassetten (ds Oligonukleotide)
+Schneiden des rekombinanten Vektors
+ersetzen einen gleich langen Teil der Original-Sequenz mit Mutationen
+können zur Genunterbrechung eine beliebige Länge aufweisen
Heterologe Expression
Expression fremder Gene in Bakterien
Was machen Expressionsvektoren für die Kontrolle der Genexpression?
codieren genetische Elemente für die Kontrolle der Genexpression:
1. Promotoren
2. Ribosomen-Bindungsstelle
3. Terminatoren
Vor und Nachteile für die Genregulation auf der Stufe der Transkription
Vortei: (oft) hohe Ausbeute an gewünschtem Protein
Nachteile: Stress, äußert sich in
-vermindertem Zellwachstum und verminderter Überlebensfähigkeit
-Verlust des Plasmids
-Mutationen, die die Expression des Proteins unterdrücken
-Bildung von fehlgefaltetem Protein
Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
Isolierung von Plasmid-DNA: Alkalische Lyse: SDS/NaOH
Reinigung von Nukleinsäuren:
+Phenol-Extraktion
+Ethanol-Fällung
+Gelfiltration
