Molekularbiologie

Question 1

Was können wir mit den Methoden der Molekularen Klonierung machen?

Answer 1

• DNA und RNA isolieren
• gezielt vervielfältigen
• Fragmente ausschneiden und einfügen
• DNA Sequenzen gezielt verändern (mutieren) und ihre Basenfolge untersuchen (sequenzieren)
• die von codierten Genen codierten Proteine exprimieren (transcribieren und translatieren)

Question 2

Was ist der Begriff für Molekulares Klonieren?

Answer 2

Einbringen eines gewünschten Gen in ein kleines, gut manipulierbares genetisches Element, den Vektor

Question 3

Was ist ‘‘Vektor’’?

Answer 3

DNA-Molekül mit Sequenzen, die die eingene Vervielfältigung (Replikation) ermöglichen und die ‘‘Fremd-DNA’’ aufnehmen kann

Question 4

Rekombinante DNA

Answer 4

Molekül, das DNA verschiedener Herkunft enthält

Question 5

Was können als Klonierungsvektoren verwendet werden?

Answer 5

-Plasmide
-Bakteriophage

Question 6

Eigenschaften vom Plamid als Klonierungsverktor

Answer 6

-auto selbst-replizierende DNA, enthält zusätzliche genetische Information, codieren zB: Resistenzen gegen Antibiotika
-besitzt eigenen Replikationsursprung (ori), besteht meistens aus zirkulärer, dsDNA, selten linear und selten aus RNA
-liegt intrazellulär in einfacher Kopie oder höherer Kopienzahl
-können sich nur intrazellulär vermehren, meistens in Bakterien oder Hefe, Pilzen

Question 7

Welche Bakteriophagen können als Klonierungsvektoren verwendet werden?

Answer 7

-Lambda: dsDNA, kann DNA bis zu 20kb aufnehmen
-M13: ssDNA, doppelsträngige replikative Form kann isoliert und wie Plasmid verwendet werden

Question 8

Was bedeutet imkompatible Plasmide?

Answer 8

-Plasmide aus einer Familie haben gleiche Replikationsgene
- 2 Plasmide aus einer Familie können in Zelle nicht koexistieren-inkompatible

Question 9

Warum können Plasmide aus einer Familie nicht in Zelle coexistieren?

Answer 9

-Konkurrenz um eine Membranbindungsstelle des Replikationsursprungs
-Ein Gen nahe des ori codiert eine RNA, die komplementär zur Primer-RNA des zweiten Plasmids ist und dessen ori durch Hybridisierung inaktiviert

Question 10

Wie repliziert Plasmid?

Answer 10

-die meisten replizieren wie bakterielle Chromosomen
-Manche Plasmide replizieren (wie einige Viren) nach dem Mechanismus der ‘‘RCA’‘-Rolling circle amplification

Question 11

Mechanismus des RCA

Answer 11

-Ein Strang der ds DNA wird durch eine Endonuklease an einer spezifischen Sequenz geschnitten –> Ein Strang mit freiem 3’- und 5’-Ende
-3’-OH des geschnittenen Strangs wird von DNA-Polymerase als Primer genutzt –> Nukleotide mit 5’-Triphosphat weiter an 3’-OH verbunden
–> ungeschnittener DNA-Strang repliziert –> Rollen –> Einzelstrangbruch wird zum Doppelstrang

Question 12

Warum werden Plasmide von Zellen repliziert?

Answer 12

Weil Plasmide für Zellen nützliche Gene codieren, wie:
-Resistenzen (zB: gegen Antibiotika wie beta-Lactam, Chloramphenicol)
-Aggression und Virulenz
-Stoffwechselwege

Question 13

Erforderungen für die Klonierung der DNA

Answer 13

-das Herausschneiden eines Gens oder Genfragments von Interesse
-das Verbinden des Gens oder Genfragments mit einem Vektor
-Möglichkeit zur Nutzung oder Manipulation der isolierten genetischen Infomation

Question 14

Spezifische Werkzeuge für Klonierung von DNA

Answer 14

Nukleasen, Restriktionsenzyme
Ligase

Question 15

Restriktionsenzyme

Answer 15

-schneiden innerhalb DNA-Sequenzen
-erkennen palindromische Sequenzen aus 4,6 oder 8 Basenpaaren
-sind eng verknüpft mit Methylierungsenzymen

Question 16

Was macht Ligase? Für welche Bindungsstelle ist sie effizient?

Answer 16

-erkennt ‘‘nicks’’, katalysiert die kovalente Verknüpfung der freien Ende unter Verbrauch von ATP
-Vorraussetzung: 3’-OH und 5’-Phosphat
-effizient für sticky ends
-Ligase des Bakteriophage T4 verbindet auch blunt ends

Question 17

4 Schritte für das Einfügen von Genen in Vektoren

Answer 17

1. Vektor und Insert werden so geschnitten, dass kompatible sticky ends entstehen (idR mit gleichen Restriktionsenzymen)
2. Die geschnittene Fragmente werden gemischt
3. sticky ends hybridisieren
4. Ligase verknüpft das Rückgrat der DNA

Question 18

Mögliche Probleme bei der Klonierung von Genen und Lösung

Answer 18

Probleme:
-Vektor hat mehr als eine Erkennungsstelle für das verwendete Restriktionsenzym
-Insertion erfolgt innerhalb wichtiger Gene
Lösung: Polylinker (multiple cloning site)

Question 19

2 Arten von Transformation bei der Klonierung?

Answer 19

Um DNA in Bakterienzelle einzuführen
1.Chemische Transformation: Vorbehandlung mit CaCl2, Aufnahme der DNA nach Hitzeschock
2.Elektroporation: Vorbehandlung der Zellen durch waschen mit salzarmen/salzfreien Lösungen, Aufnahme der DNA nach Spannungspuls

Question 20

Indentifikation rekombinanter Vektoren

Answer 20

-Nachweis des Plasmids aufgrund der Resistenz
-Nachweis von Insertion
1. Vermehrung von Klonen (einzeln), Plasmidisolierung, Restriktionsverdau
2. PCR
3. Verwendung zweier Resistenzmarker (Insertionsinaktivierung eines der beiden Gene)
4. Farbreaktion, zB: Blau-Weiss-Screening

Question 21

Identifikationstechnik: Blau-Weiss-Screening

Answer 21

Plasmide, die an MCS das Gen für die beta-Galactosidase (lacZ) tragen
Nach Insertion eines DNA-Fragments in MCS –> inaktive Galactosidase –> Bakterien, die erfolgreich rekombinante Vektoren enthalten –> weiße Kolonien
>< eine beta-Galactosidase gebildet –> keine rekombinante Vektoren aufweisen –> blau

Question 22

Wofür braucht man Molekulare Methode der Mutagenese von Genen?

Answer 22

zur Veränderung in der DNA Sequenzen von Genen

Question 23

Ortspezifische Mutagenese

Answer 23

+Oligonukleotid (Primer) mit gewünschter Mutation, dann verlängert mit DNA-Polymerase
+Plasmid, das aus einem methylierenden Stamm isoliert wurde (Verdau der nicht-mutierten Eltern-DNA durch Methylierungsspezifische Nuklease)

Question 24

Cassettenmutagenese

Answer 24

Synthetische DNA-Cassetten (ds Oligonukleotide)
+Schneiden des rekombinanten Vektors
+ersetzen einen gleich langen Teil der Original-Sequenz mit Mutationen
+können zur Genunterbrechung eine beliebige Länge aufweisen

Question 25

Heterologe Expression

Answer 25

Expression fremder Gene in Bakterien

Question 26

Was machen Expressionsvektoren für die Kontrolle der Genexpression?

Answer 26

codieren genetische Elemente für die Kontrolle der Genexpression:
1. Promotoren
2. Ribosomen-Bindungsstelle
3. Terminatoren

Question 26

Vor und Nachteile für die Genregulation auf der Stufe der Transkription

Answer 26

Vortei: (oft) hohe Ausbeute an gewünschtem Protein
Nachteile: Stress, äußert sich in
-vermindertem Zellwachstum und verminderter Überlebensfähigkeit
-Verlust des Plasmids
-Mutationen, die die Expression des Proteins unterdrücken
-Bildung von fehlgefaltetem Protein

Question 27

Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren

Answer 27

Isolierung von Plasmid-DNA: Alkalische Lyse: SDS/NaOH
Reinigung von Nukleinsäuren:
+Phenol-Extraktion
+Ethanol-Fällung
+Gelfiltration