Microbiologie : Diagnose van een infectieuze ziekte. Flashcards
Waarom doe je diagnostiek?
- Je wilt weten wat het is en hoe je het moet behandelen. Veel ziektes worden door verschillende pathogenen veroorzaakt en klinisch is daar niet altijd een onderscheid tussen te maken, vooral bij virussen is dat lastig.
- Voor surveillance. We willen weten wat de status is. Dit is van belang om nieuwe trends te kunnen voorspellen.
Ook bij internationale handel is dit van belang.
Wat is een duale infectie?
2 infecties tegelijk hebben.
Wat zijn de twee grootte methoden van diagnostiek?
- Kijken naar de pathogeen, direct of indirect.
- Kijken naar de antistoffen, dus naar de respons van het lichaam op de pathogeen
Geef een omschrijving van serologie
Het bekijken van een immuunrespons op een pathogeen. Je kijkt dus wat het lichaam als reactie heeft gegeven. Dit doen we meestal in serum.
Hoe kunnen we naar een pathogeen kijken?
Direct, bv via een elektronen microscoop. Een andere directe methode is naar het genoom kijken. Het nadeel hiervan is dat het genoom soms na infectie nog in het lichaam aanwezig is. De vraag is dan is dit de infectieuze vorm of is dit een restant.
Indirect, meestal bij virussen. We gaan dan een celcultuur maken en we bekijken het cytopathogeen effect.
Wat is van belang voor diagnostiek en waar loopt het meestal fout?
Een geschikt staal is zeer belangrijk. Je moet dus kennis hebben van de pathogeen.
Bv influenza is lastig te detecteren in bloed, een bloedmonster insturen zal dus niet verstandig zijn.
Andere dingen die bij staalname en verwerken van belang zijn :
- Hoe lang is het staal onderweg.
- Wanneer neem je het staal? Meestal is de acute fase het gevolg van de pathogeen en de 2e fase wordt veroorzaakt door weefselschade.
- Bij welke dieren doe je staalname. Bij normale contactdieren maar ook bij niet-normale contactdieren is het verstandig een staal te nemen. Als de niet-contactdieren ook dezelfde pathogeen hebben dan is de kans kleiner dat die pathogeen verantwoordelijk is voor het ziektebeeld bij dat ziekte dier.
- Virussen en bacterien zijn zeer gevoelig, ze zijn snel geïnactiveerd.
- Transportmedium kan van belang zijn.
Noem de nadelen van elektronen microscopie
Het neemt zeer veel plaats in, verbruikt veel energie, is niet gebruiksvriendelijk en je hebt hoge concentraties van de pathogeen nodig omdat je zover moet inzoomen.
Ook is er voorbereiding van het staal nodig zoals fixatie en kleuring met zware metalen.
Voor wat wordt elektronenmicroscopie toegepast?
Voor onderzoek naar virussen, is geen routine matige diagnose.
Je kunt op celniveau kijken en meestal zie je ook de structuur van de virussen.
Je kan ook virussen vrijgesteld zien worden van cellen dat noemen we budding.
Wat is budding?
Het vrijstellen van een virus door cellen.
Waarom heb je hoge concentraties van de pathogeen nodig bij elektronen microscopie?
Omdat je sterk moet inzoomen. Hoge concentratie vinden we terug in faeces en in zweren.
Wat is de goede standaard voor serologie en detectie van pathogenen?
Immunoassay.
Waar is immunoassay op gebaseerd?
Op de binding van een antistof met een antigen. Iedere antistof kan 1 specifiek antigen detecteren.
Wat betekent de term monoclonaal?
Een antistof in zuivere vorm is monoclonaal. Dat wilt zeggen dat die antistof maar 1 ding gaat herkennen.
Wat betekent de term polyclonaal?
Dat wilt zeggen dat we een mengsel van antistoffen hebben. De antistoffen op zichzelf zijn monoclonaal.
Polyclonale antistoffen zijn mengsels van monoclonale antistoffen.
Waarom wordt er gebruik gemaakt van primaire niet gelabelde antistoffen?
Omdat deze goedkoper zijn.
Geef uitleg over de directe en indirecte techniek van immunoassay
- Directe techniek, de antistof is gelabeld. Als het antigen aanwezig is dan krijg je binding.
Als je dan UV-licht toedient dan krijg je kleur.
Als het niet bindt dan is het antigen niet aanwezig en was je het weg. - Indirecte techniek, we gaan antistoffen gebruiken die niet gelabeld zijn. We wassen en voegen daarna de secundair toe. Vervolgens gaan we wassen en finaal gaan we bestralen.
Het nadeel hiervan is dat dit meer tijd kost.
Het voordeel is dat het goedkoper is. Maar het grootste voordeel is dat deze techniek gevoeliger is door verstering van het signaal.
Wat is een nadeel aan immunoassay?
Dat je een fluorescentie microscoop nodig hebt. Deze zijn duur. Daarom wordt er ook gebruik gemaakt van enzymen die zorgen voor een kleuromslag.
Wat is een variant op de immunoassay?
ELISA
Voor wat staat de afkorting ELISA?
Enzyme linked immunosorbens assay.
Geef kort weer hoe ELISA werkt
Je hebt een vaste fase in een 96-wellplaat. Hierin hebben we een antistof gebonden. Dit is een gekende antistof.
Je voegt het bloed toe. Als het virus aanwezig is kan er een binding plaats vinden.
Op die manier capteer je antigenen.
Dan ga je alles wassen tussendoor en voeg je een detectie antistof toe. Deze bindt op hetzelfde antigen maar op een andere plaats en die heeft een bepaalde merker zijn. Dit kan een enzym zijn maar ook fluorochroom.
Als je kleur krijgt is de detectie antistof gebonden en dus niet weggewassen. Dan moet het antigen ook aanwezig zijn.
Voor ELISA heb je een vloeibaar staal nodig. Er wordt gebruik gemaakt van een 96-wellplaat.
Een virus isoleren is moeilijker, wat heb je hiervoor nodig?
Levende cellen, dit gebeurt meestal op bevruchte kippen eieren gedaan of op dieren. We gaan kijken naar het cytopatische effect (CPE)
Een virus die een cel infecteert gaat 2 dingen doen :
- Gaat nieuwe virussen maken
- Gaat tijdens het proces de cel kapot maken. De cel verschrompeld en zal zijn functionaliteit verliezen.
Het nadeel van deze techniek is dat het traag en duur is. Ook gaan sommige virussen geen effect veroorzaken.
Op basis van het cytopathogeen effect kan je niet zeggen welk virus het is.
Dit is een indirecte methode om naar de pathogeen te kijken.
In het geval van CPE zien we ook niet hoeveel virus er aanwezig is.
Wat is een oplossing voor CPE, die niet kwantitatief is?
De oplossing hiervoor is een plaque assay.
We hebben een 96-wellplaat daarin zit een staal met virussen.
Waar de cellen verdwenen zijn uit de laag zien we geen blauw.
Het aantal plaques kunnen we tellen en op basis van de hoeveelheid kun je het aantal plaque vormende eenheden van een bepaald virus in een bepaald staal bepalen.
Bij wat en waarom maken we gebruik van een aggarose overlay?
Bij plaque assay maken we hier gebruik van.
Als een cel is geïnfecteerd in de monolaag en de cel gaat kapot dan komt het virus vrij, dit begint te drijven in het medium en gaat alle cellen in het medium infecteren. Dit zorgt dan niet voor plaques maar voor algemene infectie.
We willen bij plaque assay juist enkel plaques zien waarvan we weten dat die ontstaan is afhankelijk van 1 geïnfecteerde cel.
Is dit juist of onjuist?
Hoe sterker we verdunnen, des te meer telbare aantal plaques we krijgen.
Juist.
