Microbiologie : Diagnose van een infectieuze ziekte.

Question 1

Waarom doe je diagnostiek?

Answer 1

• Je wilt weten wat het is en hoe je het moet behandelen. Veel ziektes worden door verschillende pathogenen veroorzaakt en klinisch is daar niet altijd een onderscheid tussen te maken, vooral bij virussen is dat lastig.
• Voor surveillance. We willen weten wat de status is. Dit is van belang om nieuwe trends te kunnen voorspellen.
  Ook bij internationale handel is dit van belang.

Question 2

Wat is een duale infectie?

Answer 2

2 infecties tegelijk hebben.

Question 3

Wat zijn de twee grootte methoden van diagnostiek?

Answer 3

• Kijken naar de pathogeen, direct of indirect.

- Kijken naar de antistoffen, dus naar de respons van het lichaam op de pathogeen

Question 4

Geef een omschrijving van serologie

Answer 4

Het bekijken van een immuunrespons op een pathogeen. Je kijkt dus wat het lichaam als reactie heeft gegeven. Dit doen we meestal in serum.

Question 5

Hoe kunnen we naar een pathogeen kijken?

Answer 5

Direct, bv via een elektronen microscoop. Een andere directe methode is naar het genoom kijken. Het nadeel hiervan is dat het genoom soms na infectie nog in het lichaam aanwezig is. De vraag is dan is dit de infectieuze vorm of is dit een restant.

Indirect, meestal bij virussen. We gaan dan een celcultuur maken en we bekijken het cytopathogeen effect.

Question 6

Wat is van belang voor diagnostiek en waar loopt het meestal fout?

Answer 6

Een geschikt staal is zeer belangrijk. Je moet dus kennis hebben van de pathogeen.
Bv influenza is lastig te detecteren in bloed, een bloedmonster insturen zal dus niet verstandig zijn.

Andere dingen die bij staalname en verwerken van belang zijn :

• Hoe lang is het staal onderweg.
• Wanneer neem je het staal? Meestal is de acute fase het gevolg van de pathogeen en de 2e fase wordt veroorzaakt door weefselschade.
• Bij welke dieren doe je staalname. Bij normale contactdieren maar ook bij niet-normale contactdieren is het verstandig een staal te nemen. Als de niet-contactdieren ook dezelfde pathogeen hebben dan is de kans kleiner dat die pathogeen verantwoordelijk is voor het ziektebeeld bij dat ziekte dier.
• Virussen en bacterien zijn zeer gevoelig, ze zijn snel geïnactiveerd.
• Transportmedium kan van belang zijn.

Question 7

Noem de nadelen van elektronen microscopie

Answer 7

Het neemt zeer veel plaats in, verbruikt veel energie, is niet gebruiksvriendelijk en je hebt hoge concentraties van de pathogeen nodig omdat je zover moet inzoomen.
Ook is er voorbereiding van het staal nodig zoals fixatie en kleuring met zware metalen.

Question 8

Voor wat wordt elektronenmicroscopie toegepast?

Answer 8

Voor onderzoek naar virussen, is geen routine matige diagnose.
Je kunt op celniveau kijken en meestal zie je ook de structuur van de virussen.
Je kan ook virussen vrijgesteld zien worden van cellen dat noemen we budding.

Question 9

Wat is budding?

Answer 9

Het vrijstellen van een virus door cellen.

Question 10

Waarom heb je hoge concentraties van de pathogeen nodig bij elektronen microscopie?

Answer 10

Omdat je sterk moet inzoomen. Hoge concentratie vinden we terug in faeces en in zweren.

Question 11

Wat is de goede standaard voor serologie en detectie van pathogenen?

Answer 11

Immunoassay.

Question 12

Waar is immunoassay op gebaseerd?

Answer 12

Op de binding van een antistof met een antigen. Iedere antistof kan 1 specifiek antigen detecteren.

Question 13

Wat betekent de term monoclonaal?

Answer 13

Een antistof in zuivere vorm is monoclonaal. Dat wilt zeggen dat die antistof maar 1 ding gaat herkennen.

Question 14

Wat betekent de term polyclonaal?

Answer 14

Dat wilt zeggen dat we een mengsel van antistoffen hebben. De antistoffen op zichzelf zijn monoclonaal.

Polyclonale antistoffen zijn mengsels van monoclonale antistoffen.

Question 15

Waarom wordt er gebruik gemaakt van primaire niet gelabelde antistoffen?

Answer 15

Omdat deze goedkoper zijn.

Question 16

Geef uitleg over de directe en indirecte techniek van immunoassay

Answer 16

• Directe techniek, de antistof is gelabeld. Als het antigen aanwezig is dan krijg je binding.
  Als je dan UV-licht toedient dan krijg je kleur.
  Als het niet bindt dan is het antigen niet aanwezig en was je het weg.
• Indirecte techniek, we gaan antistoffen gebruiken die niet gelabeld zijn. We wassen en voegen daarna de secundair toe. Vervolgens gaan we wassen en finaal gaan we bestralen.
  Het nadeel hiervan is dat dit meer tijd kost.
  Het voordeel is dat het goedkoper is. Maar het grootste voordeel is dat deze techniek gevoeliger is door verstering van het signaal.

Question 17

Wat is een nadeel aan immunoassay?

Answer 17

Dat je een fluorescentie microscoop nodig hebt. Deze zijn duur. Daarom wordt er ook gebruik gemaakt van enzymen die zorgen voor een kleuromslag.

Question 18

Wat is een variant op de immunoassay?

Answer 18

ELISA

Question 19

Voor wat staat de afkorting ELISA?

Answer 19

Enzyme linked immunosorbens assay.

Question 20

Geef kort weer hoe ELISA werkt

Answer 20

Je hebt een vaste fase in een 96-wellplaat. Hierin hebben we een antistof gebonden. Dit is een gekende antistof.
Je voegt het bloed toe. Als het virus aanwezig is kan er een binding plaats vinden.
Op die manier capteer je antigenen.
Dan ga je alles wassen tussendoor en voeg je een detectie antistof toe. Deze bindt op hetzelfde antigen maar op een andere plaats en die heeft een bepaalde merker zijn. Dit kan een enzym zijn maar ook fluorochroom.

Als je kleur krijgt is de detectie antistof gebonden en dus niet weggewassen. Dan moet het antigen ook aanwezig zijn.

Voor ELISA heb je een vloeibaar staal nodig. Er wordt gebruik gemaakt van een 96-wellplaat.

Question 21

Een virus isoleren is moeilijker, wat heb je hiervoor nodig?

Answer 21

Levende cellen, dit gebeurt meestal op bevruchte kippen eieren gedaan of op dieren. We gaan kijken naar het cytopatische effect (CPE)
Een virus die een cel infecteert gaat 2 dingen doen :
- Gaat nieuwe virussen maken
- Gaat tijdens het proces de cel kapot maken. De cel verschrompeld en zal zijn functionaliteit verliezen.

Het nadeel van deze techniek is dat het traag en duur is. Ook gaan sommige virussen geen effect veroorzaken.
Op basis van het cytopathogeen effect kan je niet zeggen welk virus het is.

Dit is een indirecte methode om naar de pathogeen te kijken.
In het geval van CPE zien we ook niet hoeveel virus er aanwezig is.

Question 22

Wat is een oplossing voor CPE, die niet kwantitatief is?

Answer 22

De oplossing hiervoor is een plaque assay.
We hebben een 96-wellplaat daarin zit een staal met virussen.
Waar de cellen verdwenen zijn uit de laag zien we geen blauw.
Het aantal plaques kunnen we tellen en op basis van de hoeveelheid kun je het aantal plaque vormende eenheden van een bepaald virus in een bepaald staal bepalen.

Question 23

Bij wat en waarom maken we gebruik van een aggarose overlay?

Answer 23

Bij plaque assay maken we hier gebruik van.
Als een cel is geïnfecteerd in de monolaag en de cel gaat kapot dan komt het virus vrij, dit begint te drijven in het medium en gaat alle cellen in het medium infecteren. Dit zorgt dan niet voor plaques maar voor algemene infectie.

We willen bij plaque assay juist enkel plaques zien waarvan we weten dat die ontstaan is afhankelijk van 1 geïnfecteerde cel.

Question 24

Is dit juist of onjuist?

Hoe sterker we verdunnen, des te meer telbare aantal plaques we krijgen.

Answer 24

Juist.

Question 25

Wat is een nadeel van plaque assay?

Answer 25

Dat niet alle virussen zulke duidelijke plaques maken.

De plaques moet je zien als een gat in de monolaag, die cellen verdwijnen daar.

Question 26

Soms zijn de plaques bij een plaque assay niet duidelijk te kwantificeren, wat is dan een mogelijke oplossing?

Answer 26

Een oplossing zou kunnen zijn de fluorescente focus assay.
Aan het einde gaan we een kleuring doen met antistoffen die fluorescent gemerkt zijn.
Dit kunnen we bekijken onder de fluorescentie microscoop.

Bijkomend voordeel is dat we een bevestiging hebben van de identiteit van het virus.
We weten welk virus het is want we gebruiken gekende antistoffen.
Het is sensitiever, specifieker en sneller maar ook duurder.

Question 27

Voor wat staat TCID50?

Answer 27

Tissue culture infective dose

Question 28

Leg uit wat je met TCID50 doet?

Answer 28

Het een vorm van statistiek om de waarschijnlijkheid te bepalen van hoeveel virus er aanwezig is in een bepaald staal.

Question 29

Wat is een end-point dilution en bij wat passen we het toe?

Answer 29

Dit is een verdunningsreeks die we gaan verdunnen tot we geen effect meer zien. We spreken van een endpoint dilution.
In het endpoint hebben we geen infectie meer.

Het aantal geïnfecteerde wellen neemt als bij sterke verdunningen.

Question 30

Hoe bereken je de i-waarde en bij wat wordt het toegepast?

Answer 30

Je berekend deze door :

% geïnfecteerde wellen bij verdunning boven de % -50%
gedeeld door % van wellen geïnfecteerd boven de 50% - % wat daaronder komt.

Dit gebruiken we bij TCID50

Question 31

Hoe bereken je de titer bij TCID en wat geeft dit getal weer?

Answer 31

50% endpoint titer = 10 ^ log total verdunning boven de 50% - (I x log h)

I is de i-waarde.
Log H : Als je een verdunning hebt die telkens stappen van 10 maakt dan is het logaritme van 10 1. En daar vul je dus 1 in.

Als het getal bv uitkomt op tot 10^-3.66 en we zouden bij een verdunning van 10^-3.66 100 wellen infecteren dan hebben we statisch de kans dat er 50 wellen geinfecteerd zijn en 50 niet.

Question 32

Wat doen we bij een hemagglutinatie assay?

Answer 32

We gaan een verdunningsreeks maken van een onbekend staal met virus. Hierbij gaan we telkens een gelijk aantal rode bloedcellen toevoegen.

We krijgen dan in sommige wellen een rood stipje te zien, in andere niet, daar zien we een meer diffuus patroon.

Rood bolletje wilt zeggen : Geen virus aanwezig of te weinig virus aanwezig om te hemaglutineren.
Diffuus : De rode bloedcellen gaan naar beneden rollen maar worden gehinderd in hun val omdat we de virussen hebben die gaan de rode bloedcellen fixeren.
De rode bloedcellen blijven verspreid over de plaat.

Question 33

Wat is de hemaglutinatie titer?

Answer 33

De hoogste verdunning waarbij er nog steeds hemaglutinatie is.

Question 34

Kijken we rechtstreeks naar de pathogeen bij hemagluttinatie?

Answer 34

Nee, we kijken niet rechtstreeks. We gaan kijken naar een kleine eigenschap van het virus. We kijken of het hemaglutinerende eiwit aanwezig is en werkzaam is.

Question 35

Wat is diagnostische serologie?

Answer 35

Aantal methodes om de immuunrespons op de pathogeen te gaan meten. We gebruiken hiervoor serum en in de praktijk kijken we altijd naar antistoffen.

Question 36

Voor wat is antistoffen bekijken handig en voor wat niet?

Answer 36

Handig voor surveillance bv en voor de historiek van het dier. Niet handig voor acute diagnostiek.

Question 37

Wat doen we bij gepaarde serumstalen?

Answer 37

We nemen serumstaal tijdens de acute fase van de infectie. En na een aantal weken neem je opnieuw serum af.
Als de antistoffen gestegen zijn in de 2e fase dan kun je met grote zekerheid zeggen dat het virus op dat moment aanwezig was.

Question 38

Met wat gaat we bijna altijd werken bij de antistof detectie?

Answer 38

Met ELISA