MÉTODOS MOLECULARES

Question 1

propriedades à superfície das proteínas que afetam as propriedades biofísicas da proteína e
definem o seu comportamento durante as várias técnicas de cromatografia

Answer 1

• Aminoácidos com carga elétrica - carregados positiva ou negativamente;
• Zonas mais hidrofóbicas - são constituídas, predominantemente, por aminoácidos hidrofóbicos;
• Zonas de interação com ligandos.

Question 2

As proteínas ou outras biomoléculas, dependendo da escolha da matriz, podem ser separadas de acordo
com:

Answer 2

carga → ion-exchange chromatography
• hidrofobicidade → hydrophobic interaction chromatography
• tamanho → gel-filtration chromatography
• afinidade para determinadas moléculas → affinity chromatography

Question 3

Como funciona a gel-filtration chromatography (filtração por gel)

Answer 3

As colunas de filtração por gel (matriz sólida) contêm pequenas beads (poros) que vão oferecer resistência
à migração das moléculas:
• Proteínas maiores (isoladas ou em complexos) → migram mais rapidamente 1
• Proteínas mais pequenas → ficam retidas nos poros → aparecem por último

Question 4

Como funciona a Hydrophobic interaction chromatography ?

Answer 4

As proteínas com grandes superfícies hidrofóbicas são retidas, sendo que as moléculas mais hidrofílicas
passam com maior facilidade.

Question 5

Como funciona a Ion-exchange chromatography/troca iónica?

Answer 5

Processo no qual as colunas contêm pequenas resinas carregadas positiva (catiónicas) ou negativamente (aniónicas), sendo que as proteínas são fracionadas de acordo com as cargas à sua superfície. Saem primeiro as moléculas cuja carga é igual à das resinas ou moléculas sem carga.

Question 6

Como funciona a affinity chromatography

Answer 6

É a mais potente de todas - permite a separação mais eficiente da proteína que se pretende isolar. Tem por
base interações como, por exemplo, a interação anticorpo-antigénio: o anticorpo reconhece determinado antigénio preso na resina, ficando retido na coluna e o resto passa, ocorrendo assim a separação das partículas.

Question 7

O que são standards no SDS-page? qual o corante usado neste método?

Answer 7

proteínas cujo peso molecular já é conhecido que permitem
perceber o peso molecular de cada fração obtida pelo processo - dá uma ideia do range/intervalo de
valores do peso molecular que se consegue separar na coluna.
Azul de coomassie.

Question 8

SDS page é precedido de quê, no método cromatografia de filtração em gel de extratos de peroxissoma?

Answer 8

cromatografia de filtração em gel para separar as proteínas do
peroxissoma, de acordo com o seu peso molecular

Question 9

Caracterizar immunoblotting.

Answer 9

Realiza-se um SDS-PAGE, mas depois ocorre transferência das proteínas para uma membrana e utiliza-se
um determinado anticorpo para detetar a proteína

Question 10

Qual o corante mais sensível? Em que é que se usa? Qual o objetivo disto?

Answer 10

TÉCNICAS DE PURIFICAÇÃO DE
COMPLEXOS PROTEICOS
Utilização da coloração com nitrato de prata -
corante mais sensível
• Usam-se estes processos todos em sequência
para tentar isolar ao máximo a proteína/
complexo proteico com interesse.

Question 11

O que se verifica à medida que aumenta a purificação de complexos proteicos?

Answer 11

Verifica-se que, à medida que aumenta a
purificação, diminui a quantidade de proteínas e
do rendimento.

Question 12

Quais as duas formas em que pode ser feita a imunoprecipitação?

Answer 12

Pre-immobilized antibody approach - o anticorpo liga-se primeiramente a uma resina (proteínas com
elevada afinidade para imunoglobulinas) e imobilizam-nas, inserindo-se depois a amostra que irá ligar ao
antigénio, sendo que as proteínas que não se ligam são removidas e obtém-se, no final, o complexo
anticorpo-antigénio;
• Free antibody approach - junção do anticorpo com a amostra inicialmente, sendo que o complexo é
posteriormente captado na resina, isolando-se assim o antigénio de interesse

Question 13

Qual o objetivo da co-imunoprecipitação? Para que serve esta técnica?

Answer 13

o objetivo é verificar se há interação com outras
proteínas: se várias proteínas forem imunoprecipitadas em conjunto, significa que formam um complexo.
Esta técnica prova-se muito útil para:
• verificar uma interação entre duas proteínas
• identificar uma nova proteína utilizando uma conhecida

Question 14

O que é a MALDI-MS? Quais os passos desta técnica? O que significa o tamanho dos picos?

Answer 14

1. As proteínas são digeridas por uma protease
   (normalmente é a tripsina ) para formar a mistura dos péptidos
2. Um laser incide numa mistura de péptidos/proteínas
   sobre uma placa metálica, ionizando-os, ou seja,
   conferindo-lhes carga negativa
3. Um campo elétrico acelera os iões na amostra em
   direção a um detetor
   O tempo até ao detetor é proporcional à raiz quadrada da massa/carga. Logicamente, os péptidos de
   menor tamanho chegarão ao detetor mais rapidamente, permitindo a separação dos péptidos de acordo
   com a sua massa/carga.
   • Quanto maior for a intensidade do pico, maior será a quantidade do péptido na amostra

Question 15

O que é o peptide mass fingerprinting? Quais os fatores que podem tornar mais dificíl a análise da proteína para comparar com a base de dados?

Answer 15

Peptide mass fingerprinting - existe uma base de dados de proteínas (análise computacional). De acordo
com os espetros obtidos, procurar-se-á o semelhante na base de dados, obtendo um score de acordo
com o grau de identidade dos péptidos existentes nas proteínas da base de dados.
Fatores que podem tornar mais difícil a análise da proteína:
- mistura de péptidos muito complexa
- modificações pós-traducionais podem fazer variar a massa do péptido
- variações polimórficas
- contaminantes

Question 16

O que é a GST (GLUTATHIONE-S-TRANSFÉRASE) PULL-DOWN ASSAY ? O que se pretende concluir com o uso desta técnica?

Answer 16

É uma tipo da cromatografia de afinidade e alternativa à imunoprecipitação. Para isolar uma determinada
proteína, codificada pelo gene X é fundida com uma sequência que codifica a GST (tag), que será expressa
na E. coli. Depois, a partir de um extrato de tecidos/orgãos, prepara-se um homogeneizado. Lança-se também uma resina/beads de glutationa
que tem uma elevada afinidade para a GST.
Posteriormente, numa coluna com a resina, faz-se
passar o extrato proteico, conseguindo-se isolar
as proteínas que estavam em contacto com a
proteína de fusão.
se a proteína pGEX (resultante da fusão do gene X e do gene que codifica a GST em E. coli) interage com alguma proteína do homogeneizado.

Question 17

Como funciona a ELISA? O que significa o nome

Answer 17

É usada uma placa de 96 poços, revestida
com o anticorpo, à qual se adiciona o extrato
a cada poço, ocorrendo a ligação anticorpoantigénio. É também adicionado um segundo
anticorpo (contra o primeiro anticorpo) ligado
a uma enzima que catalisa a reação de
formação de um produto com cor. (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY).

Question 18

Quais as 3 partes da citometria de fluxo?

Answer 18

• Parte fluídica - células em suspensão fluem em fila indiana, ou seja, passa uma de cada vez
• Parte ótica - através de um volume iluminado onde refletem a luz e emitem fluorescência que é filtrada e
processada
• Parte eletrónica - está ligado a um computador onde ocorre a análise

Question 19

Como funciona a FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorting)?

Answer 19

1. Prepara-se uma suspensão concentrada de
   células identificadas com anticorpos conjugados
   com fluorocromos (moléculas que conferem
   fluorescência).
2. Fazem-se passar as células numa fila indiana por
   um único laser.
3. A luz fluorescente emitida e a luz dispersa por
   cada célula são medidas - permitem determinar
   o tamanho e a forma da célula.
4. A suspensão é posteriormente forçada por uma
   nozzle que forma droplets que contêm, no
   máximo, 1 célula e são lhes atribuídas uma carga
   elétrica negativa proporcional à fluorescência da
   célula medida anteriormente.
5. As droplets passam por um campo elétrico para
   que as que não tenham carga sejam descartadas
   e as que têm carga elétrica diferente sejam
   separadas (cell sorting).

Question 20

O que é a imunofenotipagem?

Answer 20

processo de classificação de células do sistema imunitário baseado nas suas
diferenças estruturais e funcionais. O processo é comumente utilizado para analisar e classificar linfócitos
em sub-grupos baseados na expressão de antigénios CD pela técnica de citometria de fluxo.

Question 21

Como funciona o fracionamento subcelular por centrifugação diferencial?

Answer 21

Consiste na separação/sedimentação dos componentes da amostra e é
feita de acordo com o seu tamanho e densidade (razão massa/volume).
Ao preparar um homogeneizado e centrifugá-lo com forças centrífugas
diferentes, obtém-se um pellet estratificado consoante os vários
organelos.
Posteriormente, de modo a purificar uma fração que contenha o
componente desejado, procede-se à purificação por gradientes de
densidade - sedimentação de equilíbrio/isopícnia. As moléculas sedimentam/flutuam no local onde a densidade da
solução na coluna de gradiente iguala a sua própria densidade.

Question 22

O que é a unidade de Svedberg?

Answer 22

oferece uma medida do tamanho de uma partícula com base na sua taxa de
sedimentação, ou seja, a rapidez com que uma partícula de determinado tamanho e forma sedimenta.