Méthodes d'étude des cellules et tissu Flashcards
Qu’est-ce qu’une culture cellulaire ?
L’ensemble des techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de l’organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d’origine
En quelle vue est employée la culture cellulaire ?
Elle est employée en vue d’expérimentation scientifique
Quels sont les différents comportements en culture selon le type de cellule ?
Les cellules circulantes sont en suspension et sont donc des cellules flottantes dans une phase liquide
Les cellules organisées en tissu sont adhérentes au support
Qu’est ce que des cultures primaires ?
C’est une culture de cellules qui ne proliféreront pas indéfiniment, la première culture après prélèvement
Expliquer l’importance du milieu de culture
Les cellules primaires sont très sensibles à leur environnement
Quels sont les moyens de faire développer les cultures ?
On peut utiliser un facteur de croissance, ou encore une cellule nourricière, c’est-à-dire une couche de cellules qui aidera à la prolifération des cellules d’intérêt par échange de nutriments
Qu’est-ce que les lignées cellulaires ?
Ce sont des cellules qui sont ou ont été rendues immortelles
Comment les lignées cellulaires sont-elles rendues immortelles ?
Elles sont soit cancéreuses, soit contaminées par un virus ou encore modifiées par un génie génétique
Pourquoi les cultures des lignées cellulaires sont-elles considérées comme faciles ?
Elles s’adaptent facilement aux conditions de culture artificielles, en échappant à tout phénomène de sénescence et plus ou moins à l’apoptose
Quel est le contrecoup de la facilité des cultures des lignées cellulaires ?
Elles sont exposées au risque de dérivation de souche, posant des problèmes de reproductibilité entre deux laboratoires différents
Qu’est ce que la dérivation ?
C’est un phénomène conduit par les erreurs / mutations produites lors de réplication de l’ADN, résultant à des cellules différentes des cellules souches
Donner des exemples de mécanismes de la physiologie cellulaire étudiés
Le contrôle du cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression des gènes, étude des jonctions cellulaires…
Donner des exemples d’emploi des cultures cellulaires en médecine
Elles sont utilisées pour la réalisation de greffes ou d’autogreffes, dans le dépistage des maladies génétiques, dans la thérapie génique…
Donner des exemples d’emploi des cultures cellulaires en pharmacologie
Elles sont utilisées dans l’étude pharmacologique et toxicologique de nouveaux médicaments, dans la production de substances à usages thérapeutique, la production de vaccins…
Dans quels domaines sont utilisés les anticorps ?
Les anticorps sont utilisés pour détecter l’expression d’une protéine avec le Western Blot, pour localiser une protéine dans un tissu en immunomarquage et pour rechercher des partenaires d’une protéine en immunoprécipitation
Qu’est-ce qu’un anticorps ?
C’est une glycoprotéine complexe produite par des plasmocytes en réponse à une stimulation par un antigène, et qui peut se fixer spécifiquement à l’antigène
De quoi est composé un anticorps ?
D’une chaine lourde, d’une chaine légère et d’un paratope, le site de liaison à l’antigène
Qu’est-ce que l’affinité ?
C’est la force de liaison antigène-anticorps
Qu’est-ce que l’épitope ?
C’est le déterminant antigénique
Qu’est ce que des anticorps monoclonaux ?
Ce sont des anticorps avec le même paratope et dirigés contre un seul épitope, et qui sont produits par un même clone de plasmocytes
Qu’est ce que des anticorps polyclonaux ?
Ce sont des anticorps reconnaissant multiples épitopes d’un même antigène (monospécifique) ou de plusieurs antigènes (polyspécifique)
Qu’est-ce que l’immunohistochimie ?
C’est une méthode dans laquelle l’anticorps de révélation est couplé à une enzyme qui convertit un substrat incolore en un produit coloré, permet de détecter une série de molécule sur une seule coupe
Qu’est-ce que l’immunofluorescence?
C’est le même principe que l’immunohistochimie sauf que l’anticorps est couplé à un colorant fluorescent et où les observations se feront sur un microscope UV à fluorescence
Qu’implique toujours l’immunofluorescence ?
Des anticorps couplés à une molécule fluorescente
De quelles manières se fait l’application des anticorps en immunofluorescence ?
De manière directe où l’anticorps est lié à un colorant fluorescent
De manière indirecte où le premier anticorps est révélé par un autre anticorps anti-premier qui, lui, est couplé à un colorant fluorescent
En quoi consiste une électrophorèse ?
On pose l’échantillon dans la machine traversée par un champ électrique, les différentes substances vont migrer vers l’anode positive selon leur poids moléculaire
Que signifie la position d’une substance par rapport à une autre dans une électrophorèse ?
Plus une molécule migre loin, plus son poids moléculaire est faible
Qu’est ce que le transfert après une électrophorèse par SDS-page ?
La fixation des protéines sur une membrane nitrocellulose dont on aura bloqué les sites libres au préalable pour limiter les interactions non spécifiques entre les anticorps et membrane
Qu’est-ce que la détection après le transfert ?
On va donc appliquer les anticorps sur la membrane, après incubation et quelques lavages, on révélera la présence des anticorps par autoradiographie
Que permet l’immunoprécipitation ?
La détection des partenaires d’une protéine
Qu’est-ce que le fractionnement cellulaire ?
Technique d’isolement, ou de purification basée sur le fait que les organites cellulaires ont des densités différentes
Quelles sont les étapes du fractionnement cellulaire ?
1) Dissociation et lyse cellulaire
2) Centrifugations
3) Recueil des différents culots
4) Analyse des culots pour identifier les organites
Quelles forces subit une particule dans un liquide ?
Son propre poids dirigé vers le bas et la poussée d’Archimède dirigée vers le haut
Par quelles caractéristiques les particules sont-elles définies lors de centrifugation ?
Elles sont définies par leur coefficient de sédimentation et par leur densité
Comment augmenter l’efficacité des méthodes de séparation ?
En centrifugeant dans des gradients de densité
En quoi consiste la centrifugation en gradient de densité ?
La particule s’élève dans le milieu ambiant jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité identique à la sienne
Comment analyser les différentes fractions pour retrouver les types d’organites ?
En testant, par exemple l’activité enzymatique ou encore par western blot
Qu’est-ce qu’une cytométrie de flux ?
C’est une méthode d’analyse automatique de cellules individuelles entrainées par un flux liquide en fonction d’un marqueur, de la taille, granulosité…
De quoi est constitué la cytométrie de flux ?
Elle comprend trois parties :
- un réseau fluidique constitué d’une veine liquide s’écoulant à vitesse constante
- un banc optique avec une ou plusieurs sources lumineuses et ses détecteurs
- un microprocesseur qui convertit les signaux électriques en signaux numériques
A quoi ressemble le graphe du tri de cellules selon leur composition (qualitative et quantitative) en ADN ?
Super haut pic des cellules en G1 qui rejoint un autre pic plus bas des cellules en G2 et M, et au milieu les cellules en S
Comment détecter des protéines intracellulaires ?
On perfore la membrane de petits trous grâce à un détergent puis on utilise des anticorps
Comment dégrader la matrice pour des cultures ?
Par digestion enzymatique genre la collagènase
Comment décoller les cellules entre elles ?
Grâce à la trypsine et l’EDTA
Qu’est ce que la confluence ?
C’est le degré d’écartement entre cellules, plus il est haut, plus les cellules sont proches
Qu’induit la confluence à 100% pour les cellules et les lignées cellulaires ?
Lorsque la confluence est à son maximum, les cellules arrêtent de se multiplier entrant dans la phase G0 alors que les lignées cellulaire peuvent continuer à proliférer formant plusieurs couches cellulaires
Quelle est la condition préalablement d’une co-immunoprécipitation ?
Il faut faire un lysat dénaturant avec un détergent dénaturant
Que permet le Western Blot ?
Il permet de révéler la présence d’un composé et de faire une quantification qualitative (comparaison de quantités pas précise (genre pas 2 fois plus que l’autre))
Lorsqu’une mutation code un codon stop prématuré comment est présenté le WB de la protéine mutée ?
Il présente une barre (en plus ou seule de la barre de la protéine normale) en dessous de la masse de la protéine molaire
Que nous permet de calculer le WB comportant 2 barres pour une même protéine résultant d’une mutation ?
On peut calculer le nombre d’acides aminés perdus par le codon stop prématuré grâce aux deux mesures de masse de la protéine
