Methoden 3 Flashcards
Welche Infos erhält man durch die FTIR-Spektroskopie?
über alles, was Schwingungen enthält:
Art d. Bindung, Gewicht d. Atome
Anordnung d. Atome
WW mit Nachbaratomen
Was ist das allgemeine Messprinzip spektroskopischer Verfahren?
Den untersuchten Molekülen wird Energie zugeführt. Diese versuchen, die Energie wieder loszuwerden.
Messziel: Energie verbrauch oder Details über Energie Abgabe
Wie kann Molekülen Energie zugeführt werden?
Ladung in Bewegung setzen (Elektronen, Kerne)
Thermische Stöße (T-Erhöhung)
Anwendungen der Massenspektrometrie?
Anwendung: Bestimmung von GG-Konz.
Analyse von Molekülfragmenten (Ermittlung Schnittstellen v. Proteasen, Nukleasen, Glycosidasen)
Artbestimmung (Massenspektrum bei Bakterien Artspezifisch
Vor- und Nachteile der Massenspektrometrie?
Vorteile: Extrem genau, schnell, viele Anwendungen
Nachteile: bisher kaum auf Membranproteine Anwendbar, Proteine müssen erst ionisiert werden
Prinzip der MALDI- Matrix-Methode?
- Proteine werden auf UV-absorbierender Matrix mit UV-Licht bestrahlt
- Ladung entsteht beim Verdampfen und Photooxidieren d. Matrixmoleküle
- > auf Protein Übertragen
Prinzip d. Elektrospray Verfahrens?
- Proteinlösung durch Kapillare gepresst
- positiv geladene Kapillare überträgt Ladung auf Flüssigkeit
- nach Verdampfen d. Lösungsmittels ist d. Protein geladen.
Prinzip der UV-vis Spektroskopie
Probe und Kontrolle mit monochromatischem Licht bestrahlt
-> von Probe absorbiert
Menge des absorbierten Lichts wird erfasst und mit Kontrollprobe verglichen
-> misst Anregung der äußeren Elektronen
-> überführt HOMO zu LUMO
Wie sind die optimalen Messbedingungen für UV-vis?
- so viel Licht wie möglich, darf Probe aber nicht schädigen
- Spaltbreite so eng wie möglich, aber noch genügend Licht
- Lösungsmittel mit Bedacht wählen
- Probe nicht zu dick/dünn
- kühlen hilft manchmal
wie entsteht Bandenverbreiterung?
Doppler Effekt: überlagernde Molekülbewegungen (Kühlen hilft)
Lebensdauerverbreiterung: -absorbierte Lichtzüge haben endliche Länge
- je kürzer Messdauer/Anregungswelle, desto breiter die Bande
Prinzip des Isothermalen Titrations Kaloriemeters
Gemessen: Bindungsreaktion Rezeptor + Ligand
2 Kammern (1 mit Rezeptor, 1 Referenz)
- Ligand tropfenweise zugeführt -> reagiert u. bewirkt T Sprung (ΔH pro Tropfen benötigte Heizenergie)
- Temp in Referenzkammer wird el. nachgeheizt
- T sinkt danach wieder auf Thermostat-Wert
man erhält: ΔH, ΔS, ΔG, GG-Konst, Anzahl Bindungsstellen
Prinzip der Differential-Scanning Calorimetry
für Phasenübergänge u. Proteinfaltung
- Probe u. Referenz erwärmen
- reaktionsbedingte T-Asymmetrie wird über Zusatzheizen kompensiert
Vor- und Nachteile der Kaloriemetrie?
Vorteile: kein labeln, kein Fixieren d. Proteine
Info’s ΔH, ΔS, ΔG, GG-Konst
automatisiert
Nachteile: mg-Mengen nötig
Systeme rauschanfällig -> Stöße von Luftbläschen
Was passiert beim Quenching?
Angeregte Teilchen geben die Energie nicht durch Emission (Fluoreszenz, Phosphoreszenz,…) wieder ab, sondern es kommt zu einer Intensitätsabnahme der Fluoreszenz, was zur Fluoreszenzlöschung (Quenching) führt, ohne dass dabei der Fluorophor zerstört wird.
internal conversion bis zum Grundzustand und FRET sind wohl auch Quenching-Effekte [FRET auf jeden Fall]
Was wird bei der Fluoreszenzspektroskopie gemessen?
Entweder die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der (während der Messung kontinuierlich verschobenen) Anregungswellenlänge
oder
die emittierte Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge nach Anregung mit breitem Spektrum
