Mariela Gironacci (Catab Y Biosíntesis De Lipidos, Receptores, Biosíntesis ADN, Tecnologías ADN)

Question 1

a que refiere transduccion de señales

Answer 1

una señal (cambios en la celula) genera la aparicion de un ligando. este ligando se une a un receptor y la interaccion genera modificaciones estructurales de proteinas para dar una respuesta biologica

Question 2

definicion de receptor

Answer 2

es una proteina soluble o unida a la membrana que ejerce un efecto fisiologico cuando se une su ligando natural. transducen el mensaje de la señal a la celula

Question 3

como se genera un receptor nuclear

Answer 3

varias opciones
1. la union de un agonista genera la translocacion desde membrana a nucleo
2. transloca de membrana a nucleo pero no por un agonista, sino por cambios de la celula
3. difusion lateral del receptor desde el reticulo endoplasmico
4. sintesis directa del receptor en el nucleo

Question 4

pasos de la transduccion de señales

Answer 4

1- liberacion del primer mensajero
2- recepcion del primer mensajero en los receptores
3- difusion del mensaje dentro de la celula por 2dos mensajeros
4- activacion o inhibicion de efectores para dar la respuesta fisiologica
5- finalizacion de la señal

Question 5

caracteristicas de la unioon entre molecula señal y receptor

Answer 5

-especificidad: se unen por complementariedad precisa entre ambos compuestos, uniones no covalentes
-sensibilidad: el receptor tiene alta afinidad (bajo Kd) por el ligando
-amplificacion: se genera una cascada enzimatica porque cada enzima puede activar otras.
-modularidad: proteinas tienen afinidad a diferentes ligandos formando diversos complejos enzimaticos con funciones diferentes
-integracion de señales: capacidad del sistema de recibir multiples señales por receptores distintos, viendose que la respuesta se da a la integracion de las distintas señales
-localizacion: cuando los componentes estan en una estructura subcelular, se puede regular que la respuesta se de solo ahi. el sistema puede degradar el mensaje rapido para evitar que pase a otras estructura
-divergencia: un unico receptor activado por una señal puede activar varias vias dando varias respuestas
-desensibilizacion: la activacion del receptor genera un circuito que termina desconectando o eliminando al receptor

Question 6

tipos de interacciones entre ligando y receptor

Answer 6

puentes de H
interacciones hidrofobicas
interacciones electrostaticas

Question 7

que es el bolsillo de union? que barreras hay?

Answer 7

es el sitio especifico del receptor al que se une el ligando, genera un cambio de conformacion.
la union debe superar dos barreras energeticas, una se da al atravesar el vestibulo extracelular y la otra con la union final al sitio activo

cuando se supera el vestibulo extracelular hay una deshidratacion del receptor, y esto beneficia las interacciones no covalentes–> aumenta 50% la probabilidad de union (se estabiliza el estado R*L)

Question 8

como se da la oclusion del bolsillo de union? que efecto genera?

Answer 8

cuando se une el ligando al bolsillo de union se generan cambios conformaciones que ocluyen al bolsillo, reforzando las interacciones entre ellos.
Hay un reordenamiento de loops y elementos estructurales–> se forma una tapa que bloquea la salida del ligando
tambien se crea un entorno de menores constantes dielectricas–> se forma una armadura contra el solvente–> mas fuerzas no covalentes

Question 9

modelos que explican la interaccion entre receptor y ligando

Answer 9

ajuste inducido: el ligando genera un cambio conformacional en el receptor que genera la union
seleccion conformacional: el receptor tiene multipes conformaciones en equilibrios, y el ligando se une a la conformacion complementaria estabilizandola (explica el efecto de varias moleculas a varias conformaciones dando diversidad de respuestas)

Question 10

grafico de union ligando-receptor, que es Bmax

Answer 10

se hace un grafico de union en funcion de la concentracion de ligando, dando una hiperbola que llega a la saturacion del receptor

Bmax es el valor de ligando en el que se llega a la saturacion, es la maxima capacidad de sitios de receptores presentes en la celula investigada

Question 11

formulas de union ligando-receptor

Answer 11

R + L –> RL definido por una constante kon, y a la vez RL –> R + L definido por constante koff

Ka= kon/koff= 1/Kd

Ka constante de asociacion
Kd constante de disociacion
Kd depende del contexto celular y de los transductores

Question 12

como ver Kd en un grafico de union en funcion a la concentracion de ligando

Answer 12

en la hiperbola que llega a Bmax, se busca el valor de la mitad de Bmax en el eje Y y se interpola en la hiperbola. El valor de X para que corresponde para la curva al valor de Bmax/2 es Kd

Question 13

que es el grafico de Scatchard

Answer 13

es un grafico de [RL]/[L] en funcion a [RL] que permite linealizar los resultados del grafico anterior

En este caso la pendiente es = -1/Kd y la interseccion con el eje X es el valor de Bmax

es lineal solo si es micheliana, si es alosterica se desvia de la linealidad

Question 14

como se mide la union L-R? metodos

Answer 14

-ensayos de saturacion: mide la union de diferentes cc de ligando al R. da Bmax y Kd
-ensayos de competencia: mide cooperatividad y Kd
-ensayos cineticos: mide asociacion y disociacion (kon y koff) de un ligando a R en func de tiempo

Question 15

cual es la utilidad del ensayo de competencia? como es el grafico?

Answer 15

se usa una cantidad especifica de ligando marcado radioactivamente y se lo une al receptor, y se le va agregando ligando sin marcar para competir por el sitio de union. se genera un grafico de union en funcion al ligando. se ve que va disminuyendo la union del ligando marcado, y de la curva se puede sacar el IC50, y a partir de ella puede sacarse Kd

Question 16

caracteristicas de la union L-R

Answer 16

-afinidad
-especificidad (tisular y estructural)
-saturabilidad
-reversibilidad (solo in vitro)

Question 17

caracteristicas del ligando

Answer 17

-afinidad: capacidad de forma el complejo L-R
-eficacia: capacidad de generar una respuesta biologica cuantificable luego de unirse al receptor

Question 18

que es el tiempo de residencia o de vida?

Answer 18

esta relacionado con la eficacia. es el tiempo que un ligando se mantiene unido a su receptor. mientras mayor sea el tiempo de residencia, mayor va a ser la eficacia. Kd no va a definir la eficacia ni la duracion de la accion

t= 1/koff

Question 19

de que dependen la velocidad de asociacion y la de disociacion?

Answer 19

la velocidad de asociacion es dependiente de la concentracion de ligando y de receptor (kon x [L] x [R]), mientras que la velocidad de disociacion depende solo de la interaccion L-R y no de la concentracion de cada especie (koff x [LR])

Question 20

en que influye el tiempo de residencia?

Answer 20

-afecta la duracion de la respuesta biologica
-un mayor tiempo de residencia requiere concentraciones menores para producir efecto
-define la efectividad y la duracion de la respuesta biologica. Kd solo define la afinidad, pero no define la efectividad
-rebinding, la molecula que se asocio y desasocio de un receptor puede volver a unirse o unirse a otro receptor cercano, y depende en parte de la concentracion local.

Tiempo de residencia esta influenciado por Kd y por la cc local del ligando (rebinding)

Question 21

que es la actividad constitutiva de un receptor?

Answer 21

es la actividad minima que presenta el receptor a pesar de no estar unido a un ligando. puede ser bloqueada por un agonista inverso

Question 22

diferentes conformaciones de los receptores y su efecto en la funcion

Answer 22

si nos paramos en un extremo de la conformacion activa del receptor, y en otro inactiva, tenemos grises provocados por otras conformaciones y los ligandos que se unen.
si se une un agonista, el receptor va a estar totalmente activo, y si se une un agonista inverso va a estar inactivo. pueden unirse agonistas parciales y agonistas inversos parciales dando un efecto parcial, o un antagonista que se une y no altera el equilibrio entre la conformacion activa e inactiva

Question 23

tipos de ligandos

Answer 23

-agonista: activa al 100% el receptor–> respuesta
-agonista parcial: no activa con eficacia maxima, da una respuesta parcial
-antagonista: se une al receptor pero no lo activa ni inactiva, simplemente bloquea la union a los agonistas. puede ser competitivo (reversible) o irreversible (forma uniones covalentes, debe sintetizarse nuevos receptores)
-agonista inverso: reduce la actividad del receptor, inhibe su actividad constitutiva
-modulador alosterico: se une a los sitios alostericos modificando el efecto agonista, no se une a sitio de union
-agonista sesgado: activa selectivamente determinadas vias

VER GRAFICO % RESPUESTA BIOLOGICA EN FUNCION AL LOG DE LA CC DE CADA LIGANDO

Question 24

diferencia entre ligando ortosterico, alosterico y bitopico

Answer 24

el ligando ortosterico se une al sitio de union y es el que genera el efecto per se.
los ligandos alostericos se unen a sitios alostericos y modifican la conformacion del R, modificando su actividad ya sea aumentando (modulador positivo) el efecto del ligando ortosterico o disminuyendolo (modulador negativo). tambien pueden tener un efecto neutro
un ligando bitopico puede unirse a ambos sitios del receptor modulando asi su propia actividad

Question 25

que cambios puede producir un modulador alosterico?

Answer 25

-cambios en la afinidad del ligando-receptor: se modifican kon, koff o ambas
-cambios en la eficacia del ligando ortosterico por modificacion de respuestas intracelulares
-respuesta por agonismo alosterico, pueden perturbar la señalizacion del receptor independientemente de si esta presente o no el ligando ortosterico

-un mismo ligando alosterico puede generar un efecto diferente con diferentes ligandos ortostericos, en un mismo receptor.

Question 26

otras formas de generar alosterismo sin la union de un ligando

Answer 26

-alosterismo por interaccion con la cara extracelular del receptor
-alosterismo por interaccion con la cara citosolica del receptor
-interaccion con otros receptores o proteinas de la capa lipidica (oligomerizacion)

Question 27

que efectos tiene la oligomerizacion de receptores?

Answer 27

cambios en:
-afinidad (puede verse en grafico de especificdad de union en funcion a ligando-receptor) y especificidad de la union del ligando
-señalizacion
-internalizacion del receptor
-trafico de receptor
-respuesta biologica
-sintesis del receptor

los efectos son muy diversos y depende de cada receptor

Question 28

que son los ligandos bivalentes?

Answer 28

son dos ligandos farmacoferos que estan unidos entre si por un espaciador, y esto les permite unirse simultaneamente a dos receptores distintos

Question 29

que son los ligandos sesgados? que efectos tienen?

Answer 29

normalmente luego de la respuesta biologica en los GPCR se fosforila el receptor y se le une una arrestina–> va a degradarse para finalizar la señalizacion.
un ligando sesgado puede activar vias diferentes que el ligando endogeno, porque se une a una conformacion diferente y la estabiliza dando otra via.

puede ser un agonista biased si aumenta o ateanua selectivamente algunas vias en comparacion al ligando endogeno, un receptor biased cuando toma una conformacion diferente al wild type, o un sistema biased cuando la señalizacion esta determinada por expresion relativa de transductores del receptor

(ligando, receptor o transductores pueden dar respuesta biased)

Question 30

como determinar si un ligando es sesgado/biased?

Answer 30

se mide la respuesta A a varios componentes y la respuesta B a esos mismos componentes. se hacen graficos de respuesta en funcion al log de la concentracion de agonista, y ambos graficos se juntan en un bias plot (respuesta A en funcion a respuesta B). se analiza cuales curvas se alejan del control del agonista endogeno, y esas van a ser las biased

Question 31

que es lo que demuestra la señalizacion biased?

Answer 31

demuestra que los receptores generan una multitud de conformaciones en respuesta a diferentes ligandos. permite mayor variedad de drogas con efectos secundarios reducidos

Question 32

que es la señalizacion compartimentalizada?

Answer 32

un receptor señaliza desde un compartimento determinado. por ej un receptor de memrana puede generar una via de señlizacion y luego ser endocitado en los endosomas, desde donde va a generar una via diferente a la original, una via compartimentalizada.

la respuesta que vemos es la integracion de todas las respuestas generadas por ese receptor

Question 33

que es una proteina recombinante y que es adn recombinante?

Answer 33

una proteina recombinante es aquella obtenida por adn recombinante, el cual es una union de fragmentos de adn de organismos diferentes (no es natural)

Question 34

tipos de endonucleasas de restriccion

Answer 34

-I y III: grandes complejos con actividad endonucleasa y metilasa. cortan al azar y requieren ATP
-II: reconocen secuencias palindromicas para cortar, y cortan las dos hebras dejando extremos cohesivos

-La actividad metilasa impide que la misma enzima degrade la cadena.c

Question 35

clasificacion de endonucleasas de restriccion segun donde cortan

Answer 35

-isoesquizomeras: cortan en el lugar que reconocen
-neoesquizomeras: cortan en un lugar diferente al que reconocen