Les anticorps monoclonaux Flashcards
A quelle famille appartiennent les anticorps ?
immunoglobulines
En réponse à quoi sont produits les AC ?
en réponse aux antigènes (molécule étrangère)
où (dans quoi) trouve-t-on les AC ?
dans les sérums et fluides biologiques
par quoi sont produits les AC ?
Lymphocytes B activés
Qu’est ce qui différencie les AC ?
même structure de base, mais le site antigénique varie (selon la spécificité de l’AC)
Quelle forme a un AC ?
Forme + composition
Y
2 chaînes lourdes (liées entre elle par pont S-S)
+ chaînes légères (chacune associée à une chaîne lourde par pont S-S)
où (domaine NH2 ou COOH) se trouve site antigénique ?
au niveau du domaine NH2
Qu’est ce que le fragment Fc ?
Le domaine d’activation du complément
où (domaine NH2 ou COOH) trouve-t-on le fragment Fc ?
au niveau du domaine COOH
Quelles sont les 2 voies de synthèses de nucléotides ?
Voie normale (synthèse de novo) Voie de dérivation (synthèse de secours)
Par quoi peut être bloqué la voie normale de synthèse des pyrimidines ?
par l’aminoptérine (bloque la formation des bases azotées)
Quelle est l’enzyme utilisée par la voie de dérivation ?
La thymidine-kinase (TK)
Qu’est ce que permet la thymidine-kinase ?
transformation de la dexothymidine en base nucléotide (= voie de dérivation)
Dans quel cas n’a-t-on pas de voie de dérivation ?
Si il y a une mutation du gène tk qui code pour la thymidine-kinase (TK) (cellule mutante tk-)
alors il n’y a pas de TK fonctionnelle donc par de transfo de la dexothymidine en nucléotide
Les lymphocytes B ont-ils les 2 voie de synthèse des nucléotides ?
Oui, comme toute cellule normale
Les myélomes ont-ils les 2 voie de synthèse des nucléotides ?
non, mutation dans les myélome fait que pas de voie de dérivation
Donc en présence d’aminoptérine les myélome ne sont pas viable, car plus aucun moyen de prod nt
Les LB peuvent-ils survivre en culture sans facteur de croissance ?
Non
Comment se répartissent les propriété des myélomes et des LB lors de leur fusion (= dans les hybridomes) ?
Aléatoirement (on va donc avoir des hybridomes : LB-LB myélome-myélome LB-myélome (ceux qu'on veut garder) )
quelles sont les étapes du principe de l’immunisation ?
Il Prend Il Se Casse
- injection
- prélèvement
- immortalisation
- sélection
- clonage
Un plasmocyte = ?
C’est un LB qui va se différencier et sécréter un AC particulier
Expliquer étape de l’injection
On injecte une cellule étrangère à la souris (à pls reprises) pour déclenchre une réaction immunitaire et donc que les LB se différencient en plasmocytes qui vont prod des AC
On prélève quoi ? Pourquoi ?
La rate, car c’est là que sont majoritairement concentrés les LB
Expliquer étape de prélèvement
On prélève la rate
Par broyage on va récupérer les LB
Explique l’immortalisation
On va pérenniser les LB
En les faisant fusionner avec des myélomes (cellules tumorales, donc immortelles)
On obtient plusieurs cellules hybrides
Quel est l’agent fusionnant utilisé ?
le polyéthylène glycol PEG
Expliquer la sélection
(ici on a pris des myélomes ayant une mutation de la voie de dérivation des synthèse des bases azotées - pas de TK fonctionnelles)
on a des hybrides :
LB-LB ; mylm-mylm ; LB-mylm
On cherche à ne garder que les LB pérennes (LB-mylm)
on sait que les LB ne survivent pas en culture sans facteur de croissance
et on sait que les myélomes (ici) ne sont pas viable en présence d’aminoptérine
Donc on met en culture les différents hybridomes obtenue, sans facteurs de croissance, et en présence d’aminoptérine. Ainsi seuls les LB-mylm vont survivre
Comment clone-t-on les AC ?
Par dilution limite (vu dans la partie culture cellulaire)
Expliquer clonage
Parmis nos hybridomes sélectionné, ils y en a des différents, ils produisent des AC spé chacun dirigé contre de antigènes différents.
On procède par dilution lente, pour isoler chaque type de plasmocyte, et garder ceux qu’on veut
les AC monoclonaux c’est quoi ?
= AC produits par un clone unique de LB
AC monoclonaux : homogènes ou non ?
oui (c’est tous les mêmes, avec même spé)
AC polyclonaux : homogènes ou non ?
non (pas tous les mêmes)
Si on trouve un mélange d’AC polyclonaux, est ce que l’animal est bien immunisé
oui
Peut-on coupler le fragment Fc à d’autres molécules ?
oui
molécules fluorescentes, enzymes, radioéléments, bille magnétique
Autre propriétés du fragments Fc ?
SPC (Science Physique Chimie)
- fixe la protéine A du Staphylocoque
- se colle au Plastique
- fixe et active les protéines du Complément
Le fragment Fc est-il antigénique ?
oui
donc il permet de générer des AC secondaires
(les fragments Fc (partie non variable) ont un site antigénique où peuvent se fixer des AC (ils servent d’AC secondaires)
Quels sont les outils utilisés pour le criblage cellulaire ?
Les AC primaires et les AC secondaires
expliquer pcp de marquage
le but est d’identifier des cellules dans une population, à l’aide des AC présents à la surface de ces cellules (on utilise des AC monoclonaux spécifiques de l’AG présent à la surface des cellules)
Cb de méthodes de marquage ?
2
méthode directe
méthode indirecte
Expliquer la méthode directe du pcp de marquage
On utilise un AC monoclonaux (spécifique des AG sur la cellules qu’on veut localisée) couplé à un fluochrome, donc rend la cellule cible fluorescente et repérable
Expliquer la méthode indirecte du pcp de marquage
On utilise des AC dirigé contre la cellule exprimant l’AG, mais on utilise des AC primaires (qui ne sont pas couplé au fluochrome).
Puis dans un deuxième temps on utilise des AC secondaire couplé à du fluochrome, qui vont être dirigés contre le fragment Fc de l’AC primaire (qui lui est sur la cellule avec l’AG) -> fluorescents donc repérables
But du double marquage ?
différencier 2 cellules A et B
expliquer pcp de double marquage
On veut différencier 2 cellules A et B, exprimant 2 AG différents (Ou idem pour 1 cellules avec 2 AG différents). On utilise donc 2 AC différents. On couple ces AC à du fluochrome, mais de couleurs différentes, on pourrai ainsi différencier les 2 cellules en fct de la couleur
analyse au cytomètre de flux ou microscope à fluorescence
pcp général/but de la cytométrie de flux ?
Analyser -Rapidement des suspensions cellulaires -mono-dispersées défilant devant -source lumineuse (LASER)
Pour fonctionner la cytométrie de flux à besoin de la combinaison de pls systèmes, lesquels ?
FOI
- système fluidique
- Système optique
- Système informatique
Expliquer le fonctionnement de la cytométrie de flux
Population cellulaire séparée dans 2 tubes
1ère partie = avec un AC control ou irrelevant
cellules de cette permière partie passe, 1 par 1, devant un flux lumineux, qui les analyse selon taille, granulosité, fluorescence, puis fait un point sur l’ordi pour chaque cellule –> nuage de point –> la limite = seuil de positivité
Idem avec 2ème partie = avec un AC spécifique
–> pts > seuil de positivité = cellules ayant réagi avec l’AC spé + cellules avec l’AG qu’on cherche –> on peut déterminer le pourcentage de ces cellules à partir du nuage de points et du seuil de positivité.
Quels sont les paramètres relevés pour les cellules par le flux lumineux dans la cytométrie de flux ?
TGF
Taille
Granulosité
Fluorescence
Les cellules présentant l’AG sont représenter au dessUs ou au dessOUs du seuil de positivité ?
(cytométrie de flux)
Au dessus
Quels AC dans la 1ère part ?
Quels AC dans la 2ème part ?
(cytométrie de flux)
Part 1 -> AC control ou irrelevant
Part 2 -> AC spé
Quelles sont les méthodes de séparation cellulaire utilisant les AC ? (4)
- Déplétion par le complément
- Séparation par “panning”
- Tri par cytomètre de flux
- Séparation par tri magétique
“L’AC active un complément qui lysera la cellule exprimant l’AG” Correspond à quelle méthode de séparation cellulaire ?
Déplétion par le complément
“L’AC fixé sur le support plastique séquestres les cellules exprimant l’AG” Correspond à quelle méthode de séparation cellulaire ?
Séparation par “panning”
“utiliser le marquage par des AC fluorescents pour trier les cellules” Correspond à quelle méthode de séparation cellulaire ?
Tri par cytomètre de flux
“L’AC retient les cellules sur l’aimant grâce à son association aux billes magnétiques” Correspond à quelle méthode de séparation cellulaire ?
Séparation par tri magnétique
épitope =
Portion d’une protéine différente d’une espèce à l’autre
expl : p- EGF chez l’Homme et la souris : 70% de la protéine est idem, les 30% qui restent sont des épitopes
Les fragments Fc peuvent-ils s’associer à une enzyme ?
oui
Les fragments Fc peuvent-ils se coller à un support plastique ?
oui
+ de H+ dans le cytoplasme ou dans les lysosomes ?
Dans les lysosomes
Quel est le but de la méthode par dosage ELISA ?
Identifier une protéine
Expliquer la méthode par dosage ELISA
On va prendre en sandwich, entre 2 AC la protéine recherchée.
On a les AC1 (dirigés contre un épitope 1 de la protéine) fixé au support.
Les protéines en question viennent se fixer aux AC1 par l’épitope1
Puis les AC2 (dirigés contre un épitope 2 de la même protéine) va se fixer
(Les AC2 sont couplé à une enzyme)
L’enzyme couplé aux AC2 va réagir avec un substrat chromogène»_space;= va changer la couleur une fois la réaction faite»_space; on peut déterminer la concentration en mesurant la densité optique
ELISA : quelle est l’enzyme couplée aux AC2 ?
peroxydase
ELISA : avec quoi réagit l’enzyme couplé aux AC2 ?
un substrat chromogène
