La cellule

Question 1

Quelles sont les 2 caractéristiques principales d’une cellule vivante? Quelles sont ces 3 principales fonctions?

Answer 1

1. Une cellule vivante est isolée de l’environnement par une membrane plasmique (barrière sélective qui comprend des transporteurs).
2. Une cellule vivante est capable de croissance et de reproduction autonome par l’expression de gènes encodés dans une ou plusieurs molécules d’ADN.
3. Elle concentre les nutriments
4. Elle conserve les produits de synthèse
5. Elle excrète les déchets

Question 2

Où est situé l’information héréditaire?

Answer 2

Dans l’ADN.

Question 3

Quel est le dogme central de la biologie cellulaire?

Answer 3

C’est que l’ADN se fait transcrire en ARN qui est ensuite traduit en protéine. L’ADN se réplique aussi afin de donner naissance à d’autres cellules.

Question 4

Combien de cellules on fabrique par secondes? Quelle est la majorité de ces cellules?

Answer 4

On en fabrique 3.8 millions par seconde. La majorité sont des cellules sanguines.

Question 5

Comment représenter en chiffre les cellules et l’ADN que contient le corps humain?

Answer 5

Le corps humain contient 10^14 cellules et autant de bactéries. Chacune contient 2 mères d’ADN. Cela représente donc 5 millions de fois le tour de la terre ou 1300 fois la distance entre la terre et Le Soleil.

Question 6

On distingue 2 grands groupes de cellules vivantes. Quels sont-ils? Quelles sont leurs caractéristiques?

Answer 6

Les procaryotes (animaux et plantes) :
1. Sont dépourvus de noyau
2. Possèdent une paroi cellulaire

Les eucaryotes :
1. Possèdent un noyau
2. Comprennent les unicellulaires (amibe, levure, et …) et les multicellulaires.

Question 7

Quels sont les 2 sous-groupes des procaryotes?

Answer 7

Les bactéries (ou eubactéries)

Les archéobactéries

Question 8

Quelles sont les caractéristiques des archéobactéries?

Answer 8

Ce sont certaines bactéries qui sont méthanogènes ou thermophiles.

Elles n’ont pas de noyau, mais comportent certaines caractéristiques biochimiques propres aux eucaryotes (réplication, transcription, traduction [histone et introns, etc…]).

Question 9

Pourquoi les virus occupent-ils une position unique entre le vivant et le non-vivant?

Answer 9

1. Ils sont composés de la même matière que les cellules
2. Ils sont incapables de vivre indépendamment d’une cellule hôte. Ils ont aussi besoin d’une cellule hôte pour se reproduire.
3. Ils ont évolués parallèlement aux cellules.
4. Leur matériel génétique peut être de l’ADN ou de l’ARN.

Question 10

Comment les virus sont-ils appelés chez les bactéries?

Answer 10

Phases.

Question 11

Vrai ou faux? Un virus n’ayant pas beaucoup de gènes sera facile à éradiquer.

Answer 11

Faux. Par exemple, le virus du COVID-19 comporte seulement 12 gènes tandis que l’humain en comporte environ 20 000. Cela ne le rend pas plus facile à contrôler.

Question 12

Comment expliquer le schéma général de la cellule eucaryote?

Answer 12

Les cellules eucaryotes animales possèdent une organisation microscopique généralement connue.

Les cellules sont délimitées par une membrane plasmique qui définit le cytoplasme.

Elles contiennent un noyau délimité par une membrane nucléaire double.

À l’intérieur du cytoplasme se retrouvent les organites cytoplasmiques.

Question 13

Qu’est-ce que le cytoplasme?

Answer 13

C’est la combinaison du cytosol et des organites.

Question 14

Identifiez et nommez les principaux constituants microscopiques de la cellule.

Answer 14

Voir photo dans le livre

Question 15

Comment expliquer la structure de la cellule eucaryote? Comment la comparer avec la procaryote?

Answer 15

La cellule eucaryote est 10x plus grande (linéaire) et 1000x plus large en volume que la cellule procaryote.

La cellule eucaryote possède un cytosquelette.

Les membranes internes délimitent les compartiments impliqués dans la digestion et la sécrétion.

Elles n’ont pas de paroi cellulaire comme les bactéries et peuvent modifier leur forme pour la phagocytose.

Question 16

Comment expliquer l’évolution de la cellule eucaryote?

Answer 16

C’est une cellule procaryote primordiale prédatrice qui capturait d’autres cellules (membrane cellulaire souple et un cytoplasme complexe capable de faire bouger cette membrane).

Question 17

Pourquoi étudier le fonctionnement de la mouche, la grenouille ou de la souris nous aide à comprendre l’humain?

Answer 17

Parce que les êtres vivants bien qu’infiniment variés vus de l’extérieur sont fondamentalement semblables de l’intérieur. Ils partagent touts les mêmes mécanismes de fonctionnement.

Question 18

Quelles sont les caractéristiques de la levure? Pourquoi est-elle un bon modèle pour l’étude des eucaryotes?

Answer 18

Premièrement, ce sont des cellules eucaryotes dans les problèmes du développement multicellulaire puisque ce sont des organismes unicellulaire.

La levure se cultive facilement et se divise très rapidement.

Elle se reproduit par voie végétative ou par voie sexuée.

Son génome est très petit.

Question 19

Pour quelle sphère utilise-t-on la levure dans la recherche?

Answer 19

Pour étudier le cycle cellulaire.

Question 20

Quels sont les 4 espèces qui sont des modèles d’organismes pour les études en biologie?

Answer 20

1. Le ver nématode Caenorhabditis elegans, 1000 cellules.
2. La mouche Drosophila melanogaster
3. La souris Mus musculus
4. L’Homo sapiens (séquençage du génome). 1014 cellules, 20000 gènes, 3 x 109 pb.
   En embryologie: aussi la grenouille Xenopus laevis et le Zebrafish (poisson zèbre).

Question 21

À quoi sert l’isolement de cellules? Quelle est la contrainte ?

Answer 21

À étudier les composés de la cellule pour les caractériser de façon biochimique (aussi: cultiver les cellules pour tester des drogues, étudier la fonction des gènes par transfection, faire pousser des virus et les étudier…).

Pour ce faire, on a besoin d’un nombre suffisant de cellules d’un même type.

Question 22

Comment les cellules sont-elles isolées en cas de protéines abondantes?

Answer 22

1. Directement d’un tissu (d’un type majoritaire): actine (muscle) et tubuline (cerveau).
2. Après amplification en culture primaire (sans autre purification).

Question 23

Quelles sont les étapes pour isoler des cellules? Qu’est-ce qu’on doit utiliser?

Answer 23

1. Défaire la matrice extracellulaire et les jonctions intercellulaires
   En utilisant des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase)
   EDTA : permet de dissocier les cellules entre elles
   Séparation par agitation douce.

Question 24

Quand est-il nécessaire de faire un enrichissement supplémentaire d’un type cellulaire?

Answer 24

Pour une manipulation génétique ou si la protéine étudiée est rare, il sera nécessaire de faire un enrichissement supplémentaire d’un type cellulaire.

Question 25

Comment les cellules d’une population complexe sont isolées?

Answer 25

Les cellules d’intérêt sont séparées avec un fluorescence-activated cell sorte (FACS).

Question 26

Quel est le principe et le fonctionnement du FACS?

Answer 26

Principe : un anticorps qui reconnaît un antigène situé à la surface d’un type cellulaire spécifique est couplé à une molécule fluorescente.

Fonctionnement :
1. De fines gouttes contenant une cellule passent à travers le faisceau d’un rayon laser.
2. Une goutte contenant une cellule fluorescente sera détectée par le laser et chargée négativement par celui-ci. Une goutte ne contenant pas de cellule fluorescente sera chargée positivement par le laser.
3. Les charges négatives et positives sont séparés dans différents contenant par un champ électromagnétique.

Le FACS détecte une cellule fluorescente sur 1000 et peut traiter des milliers de cellules à la seconde.

Question 27

Expliquez le principe de purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques.

Answer 27

1. Un anticorps biotiné étant spécifique à un certain type cellulaire sera mélangé avec des cellules.
2. Des billes magnétiques conjuguées avec de la streptavidin sont ajoutées dans le mélange.
3. La streptavidin se lie à la biotine, ce qui rend la population cellulaire d’intérêt magnétique.
4. Un aimant est ensuite collé au tube afin d’attirer les cellules magnétiques.
5. Le surnageant est retiré et dépendamment de la technique de sélection, les cellules d’intérêt se retrouveront soit dans le tube ou dans le surnageant.

Question 28

Quelle est la différence entre la sélection positive et négative dans la purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques?

Answer 28

Négative : les cellules qui seront magnétisées seront toutes les cellules sauf les cellules d’intérêt.

Positive : seules les cellules d’intérêt sont magnétisées

Question 29

Quel est l’avantage de la purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques par rapport au FACS?

Answer 29

Cette technique permet de purifier un plus grand nombre de cellules rapidement. La méthode du FACS trie une cellule à la fois tandis que cette méthode permet de trier un plus grand nombre de cellules en même temps.

Question 30

Qu’est-ce que la culture cellulaire? Pourquoi est-ce utile? Quelles sont les différentes façons de faire?

Answer 30

La plupart des cellules dissociées de tissus peuvent pousser dans un environnement-milieu approprié supplémenté avec 10% de sérum (veau, veau foetal…) et des facteurs de croissance. On les manipule de façon stérile et on les conserve dans un incubateur à 37oC et 5% CO2. On les congèle en présence de DMSO (cryo-préservateur) et on les conserve dans l’azote liquide (-196oC).

Utile pour les manipulations génétiques et pour tester différentes substances (drogues, hormones ou facteurs de croissance, virus, radiations…).

La culture de cellules est parfois dite faite «in vitro» (en dehors de l’organisme), alors qu’ «in vivo» veut dire dans l’organisme intact.

En biochimie, «in vitro» signifie dans du verre ou dans des tubes en absence de cellules vivantes versus «in vivo» fait dans des cellules en culture.

Question 31

Comment les cellules poussent-elles en culture cellulaire?

Answer 31

Les cellules ne poussent généralement pas en suspension (sauf les cellules sanguines). Elles requièrent une surface solide qui sont des boîtes de culture en plastique traité spécialement (polystyrène hydrophobe → après traitement chargé +).

Question 32

Qu’est-ce qu’une culture de cellule primaire? Comment on peut créer une culture secondaire avec une culture primaire?

Answer 32

Ce sont des cellules isolées directement des tissus (incluant le sang).

Lorsque les cellules arrivent à confluence, on les décolle avec de la trypsine, puis on les dilue et on les recultive. On arrive à une culture secondaire lorsque les cellules sont diluées et ne proviennent plus directement de la source primaire.

La culture secondaire correspond à la culture de cellules primaires qui sont utilisées pour ensemencer d’autres cultures et ainsi de suite.

Question 33

Combien de temps durent les cultures secondaires ?

Answer 33

Des semaines et quelques mois.

Question 34

Quels sont les avantages des cultures de cellules? Donnez des exemples.

Answer 34

Elles conservent beaucoup les propriétés du tissu d’origine. Par exemple, les fibroblastes forment du collagène, les cellules nerveuse forment des axones, les lymphocytes peuvent être stimulés par des antigènes.

Question 35

Quel est l’inconvénient principal des cultures cellulaires primaires? Pourquoi cela arrive? Quelle est la solution?

Answer 35

Les cultures primaires finissent par mourir. Par exemple, les fibroblastes vont être cultivés 25 à 40 passages seulement en raison d’une sénescence réplicative provoquée par:
1. Le raccourcissement des télomères: absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines.
2. Choc de culture: il va y avoir activation d’un mécanisme de contrôle du cycle cellulaire. Cela empêche les cellules de continuer à pousser.

Solution : On peut immortaliser des cellules et générer des lignées cellulaires.

Question 36

Comment est-il possible d’immortaliser des cellules?

Answer 36

1. En réintroduisant la télomérase.
2. En inactivant les contrôles du cycle cellulaire par l’introduction d’oncogènes (T du virus SV40, E6/E7 du virus du papillome humain).
3. Avec des produits chimiques.
4. Le choc de culture peut-être évité suite à une mutation durant la culture (fibroblastes de souris NIH-3T3). Dans ce cas, ce sont les cellules qui s’immortalisent elles-mêmes.

Question 37

Comment les phénomènes de sénescence réplicative et de choc de culture contribuent à la mort des cellules en culture primaire?

Answer 37

L’absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines entraîne le raccourcissement de la séquence de l’ADN ce qui entraîne le vieillissement des cellules.

Le mécanisme de contrôle du cycle cellulaire est activé par le choc de culture ce qui induit l’apoptose et donc la mort des cellules.

Question 38

Que sont des cellules transformées? Quelles sont leurs propriétés?

Answer 38

Ce sont des cellules dérivées de tumeurs, produites en introduisant des oncogènes ou infectées par des virus oncogéniques.

Propriétés: immortelles, prolifèrent à haute densité, pas besoin d’être attachées pour pousser, produisent des tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.

Question 39

Quelle a été la première lignée cellulaire isolée?

Answer 39

HeLa est la première lignée cellulaire isolée (1951) d’une patiente (Henrietta Lack) atteinte d’un cancer de l’utérus. On estime que 10 à 20% des lignées cellulaires des laboratoires sont contaminées par des HeLa.

Question 40

Quelles sont les différences entre les lignées cellulaires non-transformées et transformées?

Answer 40

Lignées cellulaires non transformées: obtenues en immortalisant des cellules en cultures primaires. Ces cellules ne produisent pas de tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.

Lignées cellulaires transformées: dérivées de tumeurs (ou générées par l’introduction de certains oncogènes dans des cellules primaires). Immortelles et produisent des tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.

Question 41

Qu’est-ce que la transfection? Pourquoi est-elle utilisée?

Answer 41

La transfection est le procédé par lequel on introduit un acide nucléique (ADN ou ARN) dans des cellules animales en utilisant des méthodes chimiques, physiques ou biologiques (virus). La transfection est utilisée pour étudier la fonction et la régulation des gènes et pour produire des organismes transgéniques.

Question 42

Qu’est-ce qui fait varier l’efficacité des transfections? Quelles cellules sont plus faciles à transfecter?

Answer 42

L’efficacité va varier en fonction des types cellulaires (les cellules primaires sont en général plus difficiles à transfecter) et de la méthode de transfection.

Question 43

Comment expliquer les méthodes chimiques de transfection?

Answer 43

C’est de faire rentrer dans une cellule des molécules chargées négativement dans une cellule qui possède une membrane cellulaire chargée négativement.

Pour ce faire, il faut neutraliser ou charger positivement l’ADN en le complexant avec du calcium phosphate ou des polycations (rentre par endocytose) ou des lipides pour former des liposomes (rentre par endocytose ou fusion avec la membrane plasmique).

Question 44

Comment expliquer les méthodes physiques de transfection?

Answer 44

La microinjection (cellules ES) ou l’électroporation (les cellules et l’ADN sont mis dans une cuve qui produit un champs électrique qui permet la création de pores dans la membrane plasmique pour permettre à l’ADN de rentrer).

Question 45

Qu’est-ce qu’une transfection transitoire? Quand est-ce que l’expression du gène est la plus importante?

Answer 45

Le plasmide va rentrer dans le noyau où le gène étudié sera transcrit puis traduit.

Le gène d’intérêt ne parvient pas à intégrer le génome de l’hôte et s’exprime temporairement dans l’hôte jusqu’à la division cellulaire puisqu’il n’est pas capable de se répliquer. Expression élevée pour une période de temps limitée. L’expression maximum sera atteinte 48-72 h post transfection (peut être détecté 1 à 8 jours après transfection). Le plasmide sera ensuite dégradé et dilué lors des divisions cellulaires.

Question 46

Quel type d’ADN entre le plus facilement dans les cellules?

Answer 46

L’ADN super enroulé rentre plus facilement dans les cellules (plus compacte).

Question 47

Qu’est-ce qu’une transfection stable? Qu’est-ce que cela nécessite pour fonctionner? Comment on fait pour savoir que cela a fonctionné?

Answer 47

Cela nécessite l’intégration d’ADN du plasmide dans le génome de la cellule, mais c’est un évènement rare (l’ADN du plasmide devra se briser pour s’intégrer).

Il va falloir utiliser un gène de sélection qui permettra la sélection des cellules en présence d’une drogue. on va pouvoir savoir quelles cellules ont eu une transfection stable. Ex: avec 2 millions de cellules 293T, on va obtenir seulement 200 clones (0,01%) stables avec 50% de cellules transfectées.

Si la transfection est transitoire, le gène de résistance s’exprimera de façon transitoire et il y aura donc une résistance à la drogue transitoire. Les cellules résistantes à long-terme auront intégré le plasmide qui sera transmis aux cellules filles après division cellulaire.

Le gène de sélection pourra être porté par le même plasmide ou par un plasmide différent (co- transfection). Dans le cas de la co-transfection le plasmide qui codera pour la protéine étudiée sera en excès pour augmenter la probabilité que les cellules sélectionnées contiennent les 2 plasmides.

Question 48

Quel type d’ADN rend la transfection stable plus efficace?

Answer 48

Lorsque l’ADN est linéaire.

Question 49

Qu’est-ce que le clonage? Pourquoi l’utiliser?

Answer 49

Le clonage (mettre une cellule/puit) sera nécessaire si on veut que 100% des cellules expriment le gène étudié. Si la protéine est exprimée à la surface on pourra utiliser le FACS pour trier les cellules.

Question 50

Quelles sont les méthodes biologiques de transfection? Comment caractériser l’efficacité?

Answer 50

virus recombinants dérivés de l’adénovirus (ADV), du virus adéno- associé (AAV), du γ-rétrovirus (RV) et du lentivirus (LV). Plus efficace que les méthodes chimiques/physiques. Les virus iront directement injecter leur ADN dans le noyau de la cellule.

Question 51

Quelles sont les différences entre transfection, transformation et transduction?

Answer 51

Transfection: introduction de matériel génétique dans des cellules de mammifère.

Transformation: introduction de manière non viral d’ADN dans des bactéries, des cellules eukaryotes non-animal et des cellules de plantes. Également, comme vu précédemment ce terme désigne le mécanisme par lequel une cellule animale devient tumorale.

Transduction: transfection en utilisant un vecteur viral.

Question 52

Que sont les anticorps?

Answer 52

Les anticorps ou immunoglobulines sont des protéines produites par les lymphocytes B en réponse à une molécule étrangère ou un microorganisme (antigène).

Question 53

Chez qui existent les anticorps?

Answer 53

Ils existent chez tous les organismes qui possèdent un système immunitaire.

Question 54

Que va entraîner la liaison de l’anticorps avec l’antigène?

Answer 54

La liaison va l’inactiver où le marquer pour en faire une cible par d’autres composantes du système immunitaire.

Ex:
1-Un Ac va se fixer sur la protéine d’un virus qui normalement reconnait son récepteur et donc bloquer l’infection.
2-Un Ac fixé à un antigène exprimé à la surface d’une cellule tumorale pourra être lysé par une cellule NK («natural killer») ou un macrophage.

Question 55

Qu’est-ce qu’un antigène?

Answer 55

C’est une molécule contre laquelle se développe des anticorps.

Question 56

Qu’est-ce qu’un épitope? À quoi correspond-il?

Answer 56

C’est une région spécifique sur l’antigène reconnue par un anticorps.

Dans le cas d’une protéine, un épitope correspond en général à environ 5-6 acides aminés.

Donc pour une protéine de 150 aa, il existerait en théorie au moins 30 différents épitopes potentiels et autant de populations d’anticorps et de populations différentes de lymphocytes B.

Question 57

Chaque population d’anticorps est générée par quoi?

Answer 57

Chaque population d’anticorps est générée par une population distincte homogène de lymphocytes B.

Question 58

Vrai ou faux? Une molécule pourra être plus ou moins antigénique selon sa composition ou sa structure.

Answer 58

Vrai.

Question 59

Vrai ou faux? Un antigène peut seulement générer un anticorps.

Answer 59

Faux. Un antigène peut générer différents anticorps qui reconnaîtront des épitopes spécifiques.

Question 60

Quelles sont les différences entre les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux?

Answer 60

Polyclonaux : c’est un mélange d’anticorps qui reconnaissent plusieurs épitopes d’un même antigène. Ils se retrouvent dans le sérum avec d’autres anticorps. Chaque population est en quantité limitée.

Monoclonaux : reconnaissent un seul épitope (hautement spécifique). A valu un prix Nobel à ses découvreurs Milstein et Khöler.

Question 61

Comment se fait le choix de l’espèce animal pour la production d’anticorps?

Answer 61

C’est une question de pratique seulement.

Question 62

Qu’est-ce qu’un hybridome? Quel est leur fonction?

Answer 62

C’est une cellule provenant de l’hybridation artificielle de cellules lymphoïdes normales et de cellules cancéreuses.

L’hybridome cumule les propriétés des deux cellules de départ : production d’anticorps et immortalité. Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices d’anticorps monoclonaux.

Question 63

Quel est le processus de production des hybridomes?

Answer 63

On produit des cellules hybridomes à partir de lymphocytes provenant de souris immunisées contre l’antigène d’intérêt.

1. L’antigène est injecté dans une souris pour que celle-ci produise des anticorps spécifiques.
2. La rate est prélevée
3. Les cellules cancéreuses de souris sont prélevées et fusionnés avec les lymphocytes producteurs d’anticorps grâce au polyéthylène glycol ce qui forme des hétérocaryon.
4. Les cellules sont ensuite mise dans un milieu de culture sélectif qui permettra seulement aux cellules hybrides de survivre et de se reproduire pour former des clones.
5. Identification des clones positifs en détectant l’anticorps dans le surnageant.

Question 64

Expliquez les grandes étapes du fractionnement cellulaire.

Answer 64

1. Briser les cellules par choc osmotique, vibration ultrasonique (sonicateur), broyage avec un mixer.
2. La suspension cellulaire maintenant réduite en lysat/homogénisat mais où les organites restent intactes.
3. Séparation des différents éléments.

Question 65

Quelle est le principe de centrifugation différentielle? Quels sont les éléments qui se retrouvent au fond?

Answer 65

C’est la séparation avec une ultracentrifugeuse selon la taille et la densité des composants. Elle permet de séparer des particules de dimensions très différentes.

Les éléments les plus lourds se retrouvent au fond, dans le culot.

Plus on augmente la vitesse, plus le culot contiendra des petites composantes.

Basse vitesse : cellules, noyau
Moyenne vitesse : mitochondries, lysosome, etc…

Question 66

Qu’est-ce que le fractionnement cellulaire? Qu’est-ce que cette technique permet? Quels sont les 2 types de sédimentation?

Answer 66

Une meilleure séparation est obtenue en appliquant l’homogénat sur le dessus d’une solution de sel qui remplie le tube et un gradient de concentration de solutions de sucrose.

1. Sédimentation de vitesse: permet une séparation selon la taille et la forme ou coefficient de sédimentation (valeur S).
2. Sédimentation à l’équilibre: permet une séparation selon la densité de flottaison (buoyant-density), indépendamment de la taille et de la forme. Fct de la densité du composant.

La séparation se fait en une série de bandes en fonction des vitesses.

Question 67

Qu’est-ce qu’une immunoprécipitation? Quel est le fonctionnement?

Answer 67

C’est une technique qui permet la précipitation d’un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement cette protéine.

1. On incube notre échantillon avec l’anticorps qui va se lier avec la protéine d’intérêt
2. On ajoute des protéines A ou G qui vont aussi se lier à l’anticorps
3. On centrifuge
4. La grosseur des protéines A ou G font en sorte qu’elle se retrouvent dans le fond du tube entraînant aussi l’anticorps et la protéine d’intérêt.

Question 68

Qu’est-ce qu’une co-immunoprécipitation?

Answer 68

C’est le même principe que l’immunoprécipitation sauf qu’on veut isoler un complexe protéique. L’anticorps qui sera choisi va lier seulement une des protéines du complexe mais va quand même permettre de précipiter le complexe au complet.

Question 69

Quelles sont les applications de l’IP?

Answer 69

1. Isoler des protéines d’interêt
2. Enrichissement de protéines peu abondantes
3. Étude des interactions entre les protéines et les complexes de protéines
4. Identifier des protéines inconnues dans un complexe protéique
5. Vérifier l’expression d’une protéine dans un tissu spécifique

Question 70

Expliquez le principe d’un western blot.

Answer 70

Bin la

Question 71

Quelles sont les différences entre des cellules totipotentes, pluripotentes, multipotente et des cellules souches?

Answer 71

Totipotente (embryon précoce): peut se différencier en tous les types cellulaires, embryonnaires et extra-embryonnaires (placenta et cordon ombilical).

Pluripotente: potentiel de différenciation plus faible que les cellules totipotentes mais peut redonner tous les types cellulaires et un organisme en entier. Ne peuvent pas former le placenta ni le cordon ombellical.

Multipotente: potentiel de se différencier en différents types cellulaires à l’intérieur d’une lignée spécifique. (cellules souches hématopoïétiques en leucocytes et érythrocytes)

Cellules souches: cellules non spécialisées totipotentes/pluripotentes/multipotentes (adultes et embryonnaires) desquelles dérivent des cellules spécialisées. Les cellules ES et iPS (pluripotentes): réintroduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires.

Question 72

Qu’est-ce que la différenciation cellulaire, la transdifférenciation, la dédifférenciation et la re programmation cellulaire?

Answer 72

Différenciation cellulaire: le processus par lequel les cellules se spécialisent en un « type » cellulaire.

Transdifférenciation: une cellule qui se différencie à partir d’une autre cellule différenciée sans passer par l’étape cellule souche.

Dédifférenciation: une cellule complètement différenciée retourne dans un état moins différencié.

Reprogrammation nucléaire: restaure sa pluripotentialité et le plein potentiel à se différencier dans tous les types cellulaires.

Question 73

Que sont les cellules souches? Comment se répliquent-elles? Où se retrouvent-elles?

Answer 73

Ce sont des cellules non spécialisées (adultes et embryonnaires) desquelles dérivent toutes les cellules spécialisées.

Chaque cellule fille issue de la division d’une cellule souche peut soit rester une cellule souche soit se différencier.

Se retrouvent en petit nombre dans presque tous les tissus (intestin, peau…).

Question 74

Quelles sont les caractéristiques des cellules souches embryonnaires (ES)? Comment prolifèrent-elles?

Answer 74

Proviennent du bouton embryonnaire ou masse cellulaire interne («inner cell mass, ICM») de l’embryon.

Prolifèrent indéfiniment en culture sans oncogene.

Sont pluripotentes: conservent leur potentiel de différenciation.

Ré-introduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires (adaptent leur phénotype à celui des cellules du site d’intégration).

Question 75

Quel est le potentiel en médecine pour de la thérapie cellulaire avec les cellules ES?

Answer 75

On peut en induire la différenciation avec diverses hormones ou facteurs de croissance. Il y a donc un potentiel pour remplacer et réparer tissus malades.

Muscles: dystrophie musculaire.

Cellules nerveuses: parkinson.

Cellules de Langherans (insuline): diabète.

Question 76

Quels sont les 2 problèmes avec les cellules ES? Quelle est la solution?

Answer 76

1. Une greffe qui provient d’ailleurs va nécessiter l’utilisation d’immunosuppresseurs pour éviter le rejet.
2. Problème éthique, on ne peut pas prélever des cellules ES humaines.

Solution : la re programmation nucléaire.

Question 77

Est-ce que les cellules d’un organisme adulte sont génétiquement identiques à l’oeuf fertilisé duquel elles dérivent? Comment peut-on en être sûr?

Answer 77

Briggs and King au début des années 50 suggéraient que le matériel génétique est irréversiblement altéré dès que les cellules commencent à se différencier. Cependant, Briggs et d’autres ont montré que ce n’était pas le cas.

En effet, en transférant les noyaux de cellules adultes différenciées dans des oeufs énucléés, on obtient des grenouilles adultes clonées. Cela est la preuve que tout le matériel génétique se retrouve dans une seule cellule.

Question 78

Qu’est-ce que la reprogrammation nucléaire?

Answer 78

Des cellules somatiques différenciées peuvent être reprogrammées vers un état embryonnaire (pluripotent) en transférant leur noyau dans des oocytes.

Question 79

Quelles sont les étapes de la reprogrammation nucléaire?

Answer 79

1. Prélever des cellules différenciées (ex : des cellules épithéliales)
2. Injecter ces cellules dans un œuf sans noyau.
3. On peut faire des transferts en série mais on obtiendera un organisme pareil comme celui dont nous avons prélevé la cellule épithéliale.

Question 80

Expliquez le principe du clonage reproductif chez le bovin.

Answer 80

Un noyau prélevé d’une cellule différenciée chez une vache adulte et introduit dans un œuf énucléé d’une autre vache produira un veau qui aura le même matériel génétique que la vache donneuse de cellule différenciée.

Question 81

Que se passe-t-il avec l’expression des gènes dans la reprogrammation nucléaire?

Answer 81

Des gènes silencieux dans des cellules différenciées peuvent ainsi être réactivés.

L’expression des gènes dans les cellules différenciées demeure dynamique et réversible.

Question 82

Qu’est-ce qui n’est pas éthique dans la reprogrammation nucléaire?

Answer 82

l’obtention de cellules pluripotentes requiert des ovules pour la reprogrammation ce qui est éthiquement pas acceptable.

Question 83

Que sont les cellules iPS (induced pluripotent stem cells)? Qu’est-ce qu’elles peuvent donner?

Answer 83

Ce sont des cellules pluripotentes produites à partir de cellules somatiques isolées de tissus adultes. Ré-introduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires.

Question 84

En quoi les cellules ES sont-elles différentes des cellules iPS et pourquoi ont-elles transformé les disciplines de la biologie développementale et de la médecine régénérative?

Answer 84

Les deux types de cellules sont pluripotentes, ce qui veut dire qu’elles ont la capacité de se différencier en presque tous les types cellulaires. La différence entre les deux types de cellules provient de l’origine de ceux-ci.

Les cellules ES proviennent du bouton embryonnaire, ce qui veut dire qu’une culture de cellules ES est une culture de cellules ne s’étant jamais différenciées.

Les cellules iPS sont des cellules différenciées ayant subient une dédifférentiation pour redevenir pluripotentes. Ces cellules peuvent provenir de plusieurs tissus somatiques adultes différents.

Au final, les cellules iPS sont ainsi plus “simple” à obtenir que les cellules ES, qui demandent des ovules.

Une différence importante serait si on veut utiliser ces cellules en thérapie cellulaire. En effet, les cellules greffées (différentiées) à partir d’iPS serait autologue (et donc pas de rejet de greffe possible) alors que les cellules provenant des cellules ES seraient allogéniques.

Question 85

Comment sont obtenues les cellules iPS?

Answer 85

En 2006, Takahashi et Yamanaka, produisirent les 1ères cellules souches, semblables aux cellules ES, en introduisant dans des MEF les gènes codant pour les facteurs de transcription, Oct4, Sox2, Klf4 et
c-Myc, et appelèrent ces cellules des cellules souches induites pluripotentes (iPS).

1. À partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ou du derme humain adulte on obtient des cellules somatiques différenciées.
2. Introduire des gènes spécifiques aux cellules ES (facteurs iPS) dans les cellules avec des vecteurs rétroviraux. Les cellules rouges = cellules exprimant les gènes exogènes.
3. Sélection propre aux cellules ES.
4. Obtention de cellules semblables aux cellules ES = cellules iPS.

Question 86

Comment les cellules iPS peuvent être utiles pour guérir des maladies?

Answer 86

Reprogramation de fibroblastes provenant de souris souffrant d’anémie drépanocytaire (« sickle-cell anemia ») en cellules iPS.
• Correction de la mutation par la technique de remplacement de gènes.
• Différenciation de ces cellules en cellules souches hématopoïétiques.
• Transplantation dans les souris malades et guérison des souris.

On a utilisé des cellules de la peau pour guérir une maladie qui affecte les cellules du sang, et on a pas besoin d’immunosuppresseurs!

Question 87

Quelles sont les 2 approches de thérapies génétique utilisant les cellules iPS?

Answer 87

Utilisé pour l’identification de nouveaux médicaments.

Correction par thérapie génique (addition ou édition génique).

Question 88

Quelles sont les différences entre la génétique classique et la génétique inverse?

Answer 88

Génétique classique: à partir d’un phénotype mutant on va identifier la mutation et le gène correspondant.

Génétique inverse: la technologie de l’ADN recombinant permet une approche inverse:
– Identifier le phénotype associé à un gène dont on ignore la fonction.
– En générant des cellules ou des organismes (souris) dans lesquels le gène d’intérêt a été muté.

On mute un gène pour voir ce que ça fait et ensuite on peut savoir la fonction du gène.

Question 89

Quels sont les 3 problèmes potentiels aux cellules iPS?

Answer 89

1. Utilisation des vecteurs rétroviraux ont été remplacés par des vecteurs non-intégratifs (expression transitoire des facteurs de transcription suffisante).

Explication : l’utilisation de virus comme moyen d’introduction des facteurs de reprogrammation dans la cellule présente des risques. En effet, l’ADN viral peut s’introduire dans celui de la cellule hôte provoquant des mutations génétiques chez cette dernière. Des efforts ont donc été entrepris pour développer des techniques ne nécessitant pas l’utilisation des vecteurs viraux. C’est ainsi que des équipes sont parvenues à induire la pluripotence en délivrant les différents facteurs sous la forme de protéines recombinantes ou d’ARNm28,29. Mais l’efficacité de ces deux techniques est très faible comparativement à l’approche virale et nécessite donc d’être optimisée. L’utilisation de vecteurs Sendai (vecteur viral ARN non intégratif) permet une très grande efficacité et évite la problématique de l’insertion des facteurs de reprogrammation tout en permettant une reprogrammation très efficace, y compris à partir de cellules sanguines.

2. Les facteurs iPS ont eux-mêmes un potentiel oncogénique. Donc, les cellules iPS dérivées de cette manière sont utile: pour l’étude des mécanismes des maladies, pour le criblage de médicaments, mais elles ne semblent pas appropriées pour la thérapie cellulaire.
3. De plus, il existe une variabilité intrinsèque dans le potentiel de différenciation des différentes lignées de cellules iPS. Le phénotype des cellules obtenues de sous-cultures n’est pas nécessairement relié spécifiquement à la cellule affectée dans la maladie étudiée.

Question 90

Quelle est la différence entre un clonage reproductif et un clonage thérapeutique?

Answer 90

Le clonage reproductif correspond à la méthode reproductrice artificiellement pratiquée afin de cloner un ou plusieurs êtres vivants qui posséderont un patrimoine génétique identique à leur donner.

Le clonage thérapeutique est une technique de production de matériel vivant via l’injection de cellules couches de la moelle osseuse pour remplacer un organe détruit et dont la compatibilité est assurée avec le patient. Il ne vise qu’à produire des cellules à des fins médicales.

Question 91

Qu’est-ce qu’un organisme transgénique?

Answer 91

Tout animal ou toute plante modifiée génétiquement par la délétion, l’addition ou le remplacement d’un gène est dit «transgénique».

Tout gène modifié ou ajouté est appelé «transgène».

Question 92

Qu’est-ce qui arrive lorsqu’on pratique la génétique inverse? Quels sont les différents types de mutants?

Answer 92

Il y a délétion du gène d’intérêt par ciblage génique «gene targeting». Inactivation génique chez la souris (gene knock out «KO» ou souris KO).

Différents types de mutants:
1. KO total (les 2 allèles, si non létal).
2. KO spécifique à certains tissus ou à un moment particulier. Le système Cre-Lox : permet un KO spécifique dans un tissu ou type cellulaire particulier (Fig. 5-66 plus texte associé).
3. Mutant ponctuel sur certains AA spécifiques ou certaines régions (modèle de maladie génétique).
4. Remplacement de gène: fusion du gène avec le gène qui code pour la GFP qui permet de suivre son expression in vivo.

Question 93

Quel est le processus du ciblage génique chez la souris par recombinaison homologue?

Answer 93

1. Introduction dans des cellules ES d’ADN modifié contenant des séquences d’homologie avec le gène ciblé qui pourra mener à une recombinaison homologue.
2. Un ADN transféré dans une cellule ES peut s’insérer dans un chromosome au hasard.
3. 1/1000 cet ADN remplacera une copie du gène homologue par recombinaison homologue.
4. Les cellules dans lesquelles cela se produit seront sélectionnées.
5. N’importe quel gène peut être ciblé et ainsi modifié ou inactivé.
6. Dans le cas où les 2 copies du gène sont inactivées, l’animal qui en résulte est appelé «souris invalidée» ou «knock-out» (KO).

Question 94

Comment sont inactivés les gènes chez les souris? Comment les souris KO sont produites?

Answer 94

Une version modifiée du gène est introduite dans des cellules ES par recombinaison homologue.

Sélection des rares clones formés de cellules portant le gène altéré inséré par recombinaison.

Injection des cellules mutées dans des blastocystes.

Incorporation du gène muté dans la souris adulte (mosaïque).

Croissement avec une souris normale et obtention de souris portant une copie du gène modifié dans toutes ses cellules (KO si délétion).

Le croisement de 2 souris modifiées donnera 1⁄4 des descendants homozygotes.

Question 95

Comment est-il possible de sélectionner les cellules ES qui ont eu une recombinaison homologue et non une intégration aléatoire?

Answer 95

Lors d’une recombinaison homologue, il faut que le gène d’intérêt aille une séquence homologue avec la séquence d’ADN avec laquelle il va faire la recombinaison. Si la recombinaison fonctionne, la cellule va être résistante à quelque chose. Par exemple, le gène Néor est résistant au G418.

S’il y a une intégration aléatoire, ce ne sera pas seulement le gène d’intérêt qui aura intégré l’ADN mais bien tout ce qui vient avec. Par exemple, Néor et HSV-TK. Bien que Néor est résistant à G418, HSV-TK a une faiblesse pour GCV.

Pour déterminer quelles sont les cellules qui ont eu une recombinaison homologue, il faut les mettre en présence de G418 et de GCV. Les cellules ayant eu une recombinaison homologue survivront et les cellules ayant eu une recombinaison aléatoire seront tuées par le GCV.

Question 96

Comment expliquer le système Cre-Lox chez la souris?

Answer 96

Insertion de 2 type d’ADN dans les cellules germinales dans 2 souris.

1. La recombinase Cre du bactériophage P1, sous le contrôle d’un promoteur spécifique à un tissu en particulier ou actif seulement durant une période spécifique du développement. Cela forme une souris transgénique.
2. Le gène d’intérêt qu’on désire supprimer, flanqué des sites de reconnaissance (LoxP) pour la recombinase: remplacement du gène endogène.

Croisement des souris: si la recombinase est exprimée dans le foie seulement, le gène d’intérêt sera supprimé uniquement dans le foie.

Question 97

Comment l’interférence par l’ARN (RNAi) est une façon rapide d’étudier la fonction d’un gène? Quel est le fonctionnement? Quels sont les désavantages?

Answer 97

1. Des ARN interférents sont produits à partir d’ARNdb.
2. Ils localisent leur ARN cible par appariement de bases.
3. Inhibition de la traduction et/ou destruction de l’ARN.

Interférence par l’ARN chez les eucaryotes: introduction dans une cellule ou un organisme de l’ARNdb dont la séquence nucléotidique est complémentaire à une région d’un gène qu’on veut inactiver.

Une fois l’ARN traité dans la cellule, il s’hybride avec l’ARN du gène cible et réduit son expression.

Facilite la génétique inverse, mais comporte des limitations vs un KO complet car inactive pas de façon efficace tous les gènes. Certains tissus sont résistants.

Question 98

Vrai ou faux? KO par recombinaison homologue dans cellules ES est très efficace.

Answer 98

Faux. C’est très PEU efficace.

Question 99

Des chercheurs ont montré qu’une cassure double brin augmente l’efficacité de la recombinaison homologue. Comment peut-on créer une cassure double brin à un endroit spécifique dans le génome?

Answer 99

Les ZFN et TALEN sont des protéines fusionnées au domaine nucléasique FokI alors que CRISPR est un assemblage nucléo- protéique contenant un ARN et la nucléase Cas9.

Ces 3 systèmes sont capable d’induire des coupures double brin dans l’ADN de façon séquence spécifique.

Question 100

Quel est le processus de fonctionnement des doigts de zinc (ZFN)? Qu’est-ce qui limite leur utilisation?

Answer 100

Ces protéines artificielles sont composées de peptides dits à doigts de zinc, qui reconnaissent une séquence d’ADN, et d’une nucléase (FokI) qui coupe l’ADN. Chaque peptide à doigt de zinc reconnaît une courte séquence de trois nucléotides : l’assemblage de plusieurs d’entre eux permet de cibler des séquences plus longues, de manière plus spécifique. En outre, pour couper, les nucléases à doigt de zinc agissent à deux, sur deux sites proches l’un de l’autre. Cela permet une action catalytique des enzymes FokI. Une modification génomique nécessite donc deux nucléases à doigts de zinc, dont la construction et l’assemblage sont très complexes. Cela limite leur utilisation.

Question 101

Quel est le processus du système TALEN?

Answer 101

Les TALENs (pour Transcription Activator Like-Effectors) sont également utilisés par paires, ciblant deux séquences d’ADN proches. Ils comprennent un domaine de fixation à l’ADN composé d’une combinaison de quatre peptides, chacun de ces peptides reconnaissant spécifiquement une des quatre bases de l’ADN. En jouant sur l’enchainement de ces peptides, il est possible de cibler une séquence d’ADN spécifique. Ce domaine de fixation est associé à une nucléase Fok1 qui assure la coupure double brin.

Question 102

D’où sont dérivés les ZNF et les TALEN?

Answer 102

ZFP : dérivés de facteurs de transcription eucaryotes

TALEN : dérivés de la bactérie Xanthomonas

Question 103

Quelle est la procédure de CRSIPR?

Answer 103

Cette fois c’est un ARN guide (CRISPR pour Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), et non une protéine, qui reconnait la séquence cible à couper. Il est associé à une nucléase Cas, le plus souvent Cas9, qui coupe l’ADN à cet endroit précis.

1. Après infection par un virus dans une bactérie, un morceau de l’ADN du virus est inséré dans le locus CRISPR à proximité d’une séquence PAM. Des descendants doivent être créé après cette transfection.
2. De l’ARN est transcrit à partir du locus CRISPR et s’associe avec la protéine Cas9.
3. Lors d’infections subséquente par le virus contre lequel la bactérie a été «immunisée», l’ADN de ce virus sera détruit par un ARN complémentaire associé à la Cas9.

Question 104

Comment peut-on utiliser CRISPR pour étudier la fonction des gènes?

Answer 104

Un ARN guide spécifiquement conçu et de la Cas9 vont se lier à une séquence spécifique d’ADN et la couper.

Une portion de l’ARN est requise pour l’association avec la Cas9. Une autre portion est conçue pour reconnaître des séquences dans le génome (ARN guide).

Présence obligatoire de la séquence PAM adjacente à la séquence cible. Requise pour la coupure par la Cas9 (permet à la bactérie de différencier son génome de celui du phage).

Question 105

Quels sont les 3 avantages du système CRISPR/Cas9?

Answer 105

1. Plus simple, plus rapide et plus économique que les technologies existantes pour le chercheur (TALEN, ZFN).
2. Adaptée aux approches de criblage de nombreuses cibles.
3. Utilisation de multiples séquences d’ARN de guidage pour modifier simultanément plusieurs locus différents dans un même génome.

Question 106

Que se passe-t-il après la cassure double brin (CDB) induite par ZFN, TALEN ou CRISPR?

Answer 106

Il y aura répartition de la cassure.

1. NHEJ (« non homologous end joining ») : Réparation par jonction d’extrémités non homologues. Restaure la continuité de l’ADN endommagé mais introduit des indels: insertions ou délétions (ne restaure pas la séquence initiale). Utilisée pour inactiver des gènes.
2. HDR (« homology-directed repair ») : Réparation par recombinaison homologue. Inclusion d’ADN homologue utilisée lors de la réparation. Utilisée pour modifier le génome avec précision ou pour insérer de l’ADN exogène.

L’inactivation d’un gène de façon classique se fait par recombinaison homologue alors que cela n’est pas nécessaire après coupure d’ADN.

Question 107

Résumez les systèmes de ZFN, TALEN et CRISPR.

Answer 107

Une nucléase introduite dans la cellule va cibler une séquence d’ADN spécifique afin d’y introduire une cassure double brin (CDB).

Les mécanismes intracellulaires de réparation de l’ADN seront activés.

Les CDB sont réparées par NHEJ ou par HDR.
• NHEJ: les 2 extrémités de la cassure sont rattachées ensemble. Durant ce processus quelques nucléotides sont occasionnellement insérés ou supprimés au hasard => formation d’un produit tronqué.
• HDR: fait intervenir des séquence homologues qui servent de gabarit pour la réparation de la CDB. Des mutations ou des segments d’ADN exogènes peuvent être incorporés en fournissant à la cellules un gabarit d’ADN qui possède une homologie avec les séquences adjacentes à la CDB.

Question 108

Comment on peut utiliser CRISPR pour étudier la fonction des gènes?

Answer 108

1. Utilise pour faire du remplacement de gène avec un gène muté, en fournissant l’ADN gabarit en trans.
2. Utilisation d’une protéine Cas9 mutante dépourvue d’activité nucléaire et fusionnée à des domaines protéiques d’activation ou d’inhibition de la transcription pour activer ou réprimer des gènes.

Question 109

Expliquez l’utilisation du système CRISPR/Cas9 dans du criblage à haut débit.

Answer 109

Le vecteur lentiviral va exprimer une librairie d’ARN guide et la Cas9 dans une lignée de cellules tumorales. Les cellules non infectées seront éliminées par la puromycine. Les cellules seront traitées avec une drogue anticancéreuse, puis les vecteurs-guides seront identifiés dans les populations cellulaire. Cela mène à la création de thérapies médicamenteuses.

Question 110

Comment introduire le système CRISPR/Cas9 dans les cellules?

Answer 110

Transfection de plasmides (2 plasmides ou 1 plasmide: ARN guide + Cas9).

Vecteurs viraux intégratifs ou non-intégratifs.

Transfection de Cas9 mRNA et de gRNA.

Transfection d’un complexe ribo-nucléoprotéique (gRNA + Cas9 protein).

Expression transitoire est suffisante et préférable (expression continue de Cas9 et de gRNA va augmenter les coupures hors site.

Question 111

Comment on peut utiliser le système CRISPR/Cas9 pour générer des souris KO? Quels sont les avantages?

Answer 111

On effectue une injection directement dans l’œuf fertilisé (même stratégie que pour générer une souris transgénique).

Gain de temps important et plus besoin de passer par les cellules ES. On peut obtenir un double KO facilement et rapidement.

Question 112

Comment on peut générer des souris transgénique versus des souris KO?

Answer 112

Transgénique : l’ADN d’une femelle donneuse st injecté dans un oocyte fertilisé. Formation d’un embryon implanté dans une femelle.

KO : l’ADN comportant le transgène est intégré dans des cellules ES. Les cellules ayant subit une transfection stable sont sélectionnées et injectées dans un embryon. Celui-ci est implanté dans une femelle. Le bébé de cette femelle est accouplé à une souris WT. On sélectionne les souris homozygotes descendantes de ces deux souris.

Question 113

Quels sont les problèmes de création d’une souris transgénique? Quelle est la solution?

Answer 113

L’ADN va s’intégrer au hasard dans un petit % d’oocytes. Il pourrait s’intégrer dans un locus important ou dans un endroit sujet à methylation.

Approche avec endonucléase : la modification est ciblée. Il peut y avoir des coupures hors cible. Cette approche est beaucoup plus courte qu’en passant par les cellules ES.

Question 114

Que sont ZFN, TALEN et CRISPR? Comment sont-ils fabriqués?

Answer 114

Ce sont des méthodes d’édition du génome. Ils sont fabriqués in-vitro et vont cibler une séquence d’ADN spécifique afin d’y introduire une cassure double brin.

Question 115

Quelle est la limitation incontournable pour tout microscope? Quelle est la limite de résolution des MO?

Answer 115

Pour une radiation donnée, aucun détail structural plus petit que sa longueur d’onde ne peut être résolu.

La limite de résolution d’un microscope optique (MO) est déterminée par la longueur d’onde de la lumière visible = 0,4 μm (violet) à 0,7 μm (rouge). Bactéries et mitochondries (0,5 μm) sont les plus petits éléments qui peuvent être discernées en MO.

Question 116

Qu’est-ce que la limite de résolution?

Answer 116

La distance minimale à laquelle 2 objets apparaissent distincts. Dans le meilleurs des cas, avec une lumière violette, et un excellent microscope = 0,2 μm.

Question 117

Quelle est la différence entre résolution et détection?

Answer 117

Un petit objet en deçà de la limite de résolution peut être détecté s’il émet de la lumière.

Question 118

Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence?

Answer 118

Les molécules fluorescentes absorbent la lumière à une longueur d’onde (λ) spécifique et en émettent à une λ différente.

Si on illumine une telle molécule à sa λ d’absorption puis qu’on la visualise à travers un filtre qui ne fait passer que la lumière de λ d’émission, elle rayonnera sur un fond noir.

Permet de visualiser des molécules fluorescentes endogènes (GFP) et exogènes (Ac couplé à une molécule fluorescente ou molécule s’intercalant dans l’ADN comme le DAPI).

Question 119

Que sont des sondes fluorescentes et fluorochromes? Comment est-ce utilisé?

Answer 119

Substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur d’onde.

Une méthode très utilisée consiste à coupler un fluorochrome à un anticorps. En couplant différents Ac à différents fluorochromes, on peut détecter différentes molécules dans la même cellule.

Méthode moderne de choix pour l’étude de la physiologie cellulaire: peut permettre l’observation des cellules vivantes (GFP, «green fluorescent protein» isolé de méduse) et de visualiser des structures.

Question 120

Quelles sont les différences entre immunocytochimie, immunohistochimie et immunofluorescence?

Answer 120

Immunocytochimie (cellule) immunohistochimie (tissus): Méthode de détection d’un antigène à l’aide d’un Ac couplé à une enzyme ou un fluorochrome.

Immunofluorescence: L’Ac est lié à un fluorochrome permettant de visualiser et/ou quantifier l’antigène cible. L’immunofluorescence est un type d’immunohistochimie.

Question 121

Qu’est-ce que l’immunofluorescence indirecte?

Answer 121

Les Ac sont utilisés pour détecter des antigènes spécifiques. Un Ac secondaire couplé à un fluorochrome (immunofluorescence indirecte) pourra être utilisé pour amplifier le signal ou si l’Ac primaire marqué n’est pas disponible. Il se fixera à l’Ac primaire.

Ac primaire: anti-souris reconnaitra l’antigène (espèce étudiée) produit dans le lapin.

Ac secondaire: anti-lapin produit dans la chèvre et dirigé contre l’Ac primaire de lapin et couplé à une molécule fluorescente (détectée par immunofluorescence).

Question 122

Que se passe-t-il si l’anticorps secondaire est polyclonal dans l’immunocytochimie indirecte?

Answer 122

Si l’Ac secondaire est polyclonal, plusieurs Ac marqués vont se fixer sur l’Ac primaire, et donc le signal sera amplifié.

Marqueur = enzyme ou fluorochrome.

Question 123

Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence?

Answer 123

Lorsque des fluorophores sont couplés à des anticorps, il est possible de les visualiser avec de la microscopie à fluorescence.

Question 124

Qu’est-ce que l’hybridation in situ? Comment on peut visualiser?

Answer 124

C’est une méthode de détection des acides nucléiques. On peut détecter des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques. Les sondes sont des ARN ou ADN complémentaires aux séquences d’intérêt. Cela repose sur les principes d’hybridation des acides nucléiques.

C’est appliqué sur des cellules ou des coupes de tissus et visualisé par :
1. Radioautographie grace aux nucleotides radioactifs présents dans la sonde.
2. Immunocytochimie grâce à la présence de nucleotides couples à la digoxigénine, alors détectée par un anticorps spécifique couplé à une enzyme ou à une molécule fluorescente (FISH)
3. Fluorescence grace aux nucleotides marques avec un fluorochrome présents dans la sonde.

Question 125

Comment fonctionne l’autoradiographie dans l’hybridation in situ?

Answer 125

L’autoradiographie est une technique d’imagerie d’émission réalisée à partir d’une source radioactive placée au contact d’une émulsion ou d’un film photographique. La sonde est radioactive.

Question 126

Comment expliquer la méthode FISH dans l’hybridation in situ?

Answer 126

Dans cette méthode, le nucleotide est directement marqué avec un fluorochrome ou à la digoxigénine qui sera reconnu par un Ac couplé à une molecule fluorescente (FISH).

Question 127

Que sont les quantum dots? À quoi servent-ils?

Answer 127

Les fluorochromes organiques perdent leur fluorescence rapidement. De nouveaux fluorochromes: ponts quantiques («quantum dots») sont des nanoparticules (2–10 nM) fait de séléniure de Cd. Fluorescence plus stable dans le temps (semaines) et émettent des couleurs.

Question 128

Quel est le principe de déconvolution d’image dans la microscopie à fluorescence?

Answer 128

Le microscope optique fait le point sur un plan focal donc donne une image en 2 dimensions → image ± flou.

Pour avoir une image en trois dimensions il y a 2 solutions
1. Par ordinateur déconvolution d’image
2. Confocal

Question 129

Qu’est-ce que la microscopie confocale?

Answer 129

Un laser balaye le spécimen dans toute son épaisseur et sa largeur, et concentre le faisceau lumineux sur un point à une profondeur précise du spécimen.

Les données pour chaque point sont rassemblées séquentiellement et les images produites sont enregistrées par un ordinateur. Forme une image composite de l’ensemble de la cellule ou un plan très mince de la cellule.

Question 130

Qu’est-ce que la GFP? Comment est-elle utilisée?

Answer 130

La «Green Fluorescent Protein» (GFP), isolée de la méduse, est fluorescente de façon inhérente. A été cloné en 1992 et utilisée comme étiquette in vivo en 1994.

Des mutations ont permis de générer des variants plus fluorescents et avec des couleurs différentes.

Des protéines isolées d’autres organismes marin sont également utilisées (anémone de mer et autres petits animaux marins).

Les protéines de fusion (en N- ou C-terminal) se comportent très souvent comme la protéine sauvage (vs Ac fluorescent).

Aussi, la GFP est très utilisée comme molécule- rapportrice pour suivre l’expression des gènes: ici embryon transgénique de drosophile vivant contenant la région codante de la GFP qui est exprimée sous le contrôle d’un promoteur actif dans certains neurones.

Question 131

Qu’est-ce qu’on peut utiliser en fusion avec la GFP?

Answer 131

Utilisée aussi en fusion avec un peptide-signal de localisation pour en diriger l’expression vers un organite spécifique et en étudier la distribution et la dynamique.

Question 132

Qu’est-ce qu’un gène rapporteur?

Answer 132

Un gène rapporteur est un gène dont le produit (protéine) possède une caractéristique lui permettant d’être observé en laboratoire (fluorescence, activité enzymatique détectable). Les gènes rapporteurs sont utilisés pour permettre de visualiser ou mesurer l’expression d’un gène d’intérêt, pour cela le gène rapporteur peut être fusionné au gène étudié, ou mis sous le contrôle du promoteur de ce dernier.

Question 133

Qu’est-ce que la luciférase? À quoi ça sert?

Answer 133

La luciférase isolée de la luciole va émettre de la lumière en présence du substrat luciférine que l’on mesurera avec un luminomètre

Permet d’identifier quand et où (quels tissus) un gène est exprimé ou comment sa localisation change en réponse à des stimuli.

Question 134

Que permettent les protéines fluorescentes?

Answer 134

L’utilisation des protéines fluorescentes permet d’étudier les propriétés cinétiques d’une protéine et de déterminer si elle interagit avec d’autres protéines.

Question 135

Quelle est la méthode du FRET? Que permet-elle?

Answer 135

FRET (transfert d’énergie par résonnance en fluorescence): permet de suivre les interactions entre 2 protéines.

1. Protéine X couplée à une GFP excité en violet, émettant en bleu.
2. Protéine Y couplée avec une GFP excité en bleu, émettant en vert.
3. Si X et Y sont suffisamment proches (< 5 nM) suite à une interaction, une excitation en violet produira une émission en vert.

Question 136

Qu’est-ce que la photoactivation?

Answer 136

Fait intervenir une forme inactive d’une protéine fluorescente.

Son activation va se faire à un endroit spécifique par un rayon lumineux.

Par exemple, la tubuline marquée avec une fluorescéine peut s’incorporer aux microtubules (MT) du fuseau mitotique après injection dans une cellule en division.

Question 137

Qu’est-ce que la FRAP? À quoi ça sert?

Answer 137

C’est la récupération de fluorescence après photonbanchiment.

Éteint la fluorescence de la GFP avec un puissant rayon laser dans une région spécifique. Puis, analyse du déplacement des molécules fluorescentes restantes dans la région blanchie. Donne des information sur la cinétique de la protéine.

Ici blanchiment de l’appareil de Golgi, site de recrutement de la galactosyl transférase. Inhibition de la synthèse de nouvelle molécules avec la cyclohex. Déplacement de molécules fluorescentes du RE vers le Golgi.

Question 138

Qu’est-ce que le concept d’ingénierie du génome?

Answer 138

L’ingénierie ciblée du génome humain sert à introduire des modifications spécifiques à l’ADN d’un organisme. Ces « modifications » peuvent être apportées soit aux cellules somatiques ou aux cellules germinales.