La cellule Flashcards
1
Q
Quelles sont les 2 caractéristiques principales d’une cellule vivante? Quelles sont ces 3 principales fonctions?
A
- Une cellule vivante est isolée de l’environnement par une membrane plasmique (barrière sélective qui comprend des transporteurs).
- Une cellule vivante est capable de croissance et de reproduction autonome par l’expression de gènes encodés dans une ou plusieurs molécules d’ADN.
- Elle concentre les nutriments
- Elle conserve les produits de synthèse
- Elle excrète les déchets
2
Q
Où est situé l’information héréditaire?
A
Dans l’ADN.
3
Q
Quel est le dogme central de la biologie cellulaire?
A
C’est que l’ADN se fait transcrire en ARN qui est ensuite traduit en protéine. L’ADN se réplique aussi afin de donner naissance à d’autres cellules.
4
Q
Combien de cellules on fabrique par secondes? Quelle est la majorité de ces cellules?
A
On en fabrique 3.8 millions par seconde. La majorité sont des cellules sanguines.
5
Q
Comment représenter en chiffre les cellules et l’ADN que contient le corps humain?
A
Le corps humain contient 10^14 cellules et autant de bactéries. Chacune contient 2 mères d’ADN. Cela représente donc 5 millions de fois le tour de la terre ou 1300 fois la distance entre la terre et Le Soleil.
6
Q
On distingue 2 grands groupes de cellules vivantes. Quels sont-ils? Quelles sont leurs caractéristiques?
A
Les procaryotes (animaux et plantes) :
1. Sont dépourvus de noyau
2. Possèdent une paroi cellulaire
Les eucaryotes :
1. Possèdent un noyau
2. Comprennent les unicellulaires (amibe, levure, et …) et les multicellulaires.
7
Q
Quels sont les 2 sous-groupes des procaryotes?
A
Les bactéries (ou eubactéries)
Les archéobactéries
8
Q
Quelles sont les caractéristiques des archéobactéries?
A
Ce sont certaines bactéries qui sont méthanogènes ou thermophiles.
Elles n’ont pas de noyau, mais comportent certaines caractéristiques biochimiques propres aux eucaryotes (réplication, transcription, traduction [histone et introns, etc…]).
9
Q
Pourquoi les virus occupent-ils une position unique entre le vivant et le non-vivant?
A
- Ils sont composés de la même matière que les cellules
- Ils sont incapables de vivre indépendamment d’une cellule hôte. Ils ont aussi besoin d’une cellule hôte pour se reproduire.
- Ils ont évolués parallèlement aux cellules.
- Leur matériel génétique peut être de l’ADN ou de l’ARN.
10
Q
Comment les virus sont-ils appelés chez les bactéries?
A
Phases.
11
Q
Vrai ou faux? Un virus n’ayant pas beaucoup de gènes sera facile à éradiquer.
A
Faux. Par exemple, le virus du COVID-19 comporte seulement 12 gènes tandis que l’humain en comporte environ 20 000. Cela ne le rend pas plus facile à contrôler.
12
Q
Comment expliquer le schéma général de la cellule eucaryote?
A
Les cellules eucaryotes animales possèdent une organisation microscopique généralement connue.
Les cellules sont délimitées par une membrane plasmique qui définit le cytoplasme.
Elles contiennent un noyau délimité par une membrane nucléaire double.
À l’intérieur du cytoplasme se retrouvent les organites cytoplasmiques.
13
Q
Qu’est-ce que le cytoplasme?
A
C’est la combinaison du cytosol et des organites.
14
Q
Identifiez et nommez les principaux constituants microscopiques de la cellule.
A
Voir photo dans le livre
15
Q
Comment expliquer la structure de la cellule eucaryote? Comment la comparer avec la procaryote?
A
La cellule eucaryote est 10x plus grande (linéaire) et 1000x plus large en volume que la cellule procaryote.
La cellule eucaryote possède un cytosquelette.
Les membranes internes délimitent les compartiments impliqués dans la digestion et la sécrétion.
Elles n’ont pas de paroi cellulaire comme les bactéries et peuvent modifier leur forme pour la phagocytose.
16
Q
Comment expliquer l’évolution de la cellule eucaryote?
A
C’est une cellule procaryote primordiale prédatrice qui capturait d’autres cellules (membrane cellulaire souple et un cytoplasme complexe capable de faire bouger cette membrane).
17
Q
Pourquoi étudier le fonctionnement de la mouche, la grenouille ou de la souris nous aide à comprendre l’humain?
A
Parce que les êtres vivants bien qu’infiniment variés vus de l’extérieur sont fondamentalement semblables de l’intérieur. Ils partagent touts les mêmes mécanismes de fonctionnement.
18
Q
Quelles sont les caractéristiques de la levure? Pourquoi est-elle un bon modèle pour l’étude des eucaryotes?
A
Premièrement, ce sont des cellules eucaryotes dans les problèmes du développement multicellulaire puisque ce sont des organismes unicellulaire.
La levure se cultive facilement et se divise très rapidement.
Elle se reproduit par voie végétative ou par voie sexuée.
Son génome est très petit.
19
Q
Pour quelle sphère utilise-t-on la levure dans la recherche?
A
Pour étudier le cycle cellulaire.
20
Q
Quels sont les 4 espèces qui sont des modèles d’organismes pour les études en biologie?
A
- Le ver nématode Caenorhabditis elegans, 1000 cellules.
- La mouche Drosophila melanogaster
- La souris Mus musculus
- L’Homo sapiens (séquençage du génome). 1014 cellules, 20000 gènes, 3 x 109 pb.
En embryologie: aussi la grenouille Xenopus laevis et le Zebrafish (poisson zèbre).
21
Q
À quoi sert l’isolement de cellules? Quelle est la contrainte ?
A
À étudier les composés de la cellule pour les caractériser de façon biochimique (aussi: cultiver les cellules pour tester des drogues, étudier la fonction des gènes par transfection, faire pousser des virus et les étudier…).
Pour ce faire, on a besoin d’un nombre suffisant de cellules d’un même type.
22
Q
Comment les cellules sont-elles isolées en cas de protéines abondantes?
A
- Directement d’un tissu (d’un type majoritaire): actine (muscle) et tubuline (cerveau).
- Après amplification en culture primaire (sans autre purification).
23
Q
Quelles sont les étapes pour isoler des cellules? Qu’est-ce qu’on doit utiliser?
A
- Défaire la matrice extracellulaire et les jonctions intercellulaires
En utilisant des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase)
EDTA : permet de dissocier les cellules entre elles
Séparation par agitation douce.
24
Q
Quand est-il nécessaire de faire un enrichissement supplémentaire d’un type cellulaire?
A
Pour une manipulation génétique ou si la protéine étudiée est rare, il sera nécessaire de faire un enrichissement supplémentaire d’un type cellulaire.
25
Comment les cellules d’une population complexe sont isolées?
Les cellules d’intérêt sont séparées avec un fluorescence-activated cell sorte (FACS).
26
Quel est le principe et le fonctionnement du FACS?
Principe : un anticorps qui reconnaît un antigène situé à la surface d’un type cellulaire spécifique est couplé à une molécule fluorescente.
Fonctionnement :
1. De fines gouttes contenant une cellule passent à travers le faisceau d’un rayon laser.
2. Une goutte contenant une cellule fluorescente sera détectée par le laser et chargée négativement par celui-ci. Une goutte ne contenant pas de cellule fluorescente sera chargée positivement par le laser.
3. Les charges négatives et positives sont séparés dans différents contenant par un champ électromagnétique.
Le FACS détecte une cellule fluorescente sur 1000 et peut traiter des milliers de cellules à la seconde.
27
Expliquez le principe de purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques.
1. Un anticorps biotiné étant spécifique à un certain type cellulaire sera mélangé avec des cellules.
2. Des billes magnétiques conjuguées avec de la streptavidin sont ajoutées dans le mélange.
3. La streptavidin se lie à la biotine, ce qui rend la population cellulaire d’intérêt magnétique.
4. Un aimant est ensuite collé au tube afin d’attirer les cellules magnétiques.
5. Le surnageant est retiré et dépendamment de la technique de sélection, les cellules d’intérêt se retrouveront soit dans le tube ou dans le surnageant.
28
Quelle est la différence entre la sélection positive et négative dans la purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques?
Négative : les cellules qui seront magnétisées seront toutes les cellules sauf les cellules d’intérêt.
Positive : seules les cellules d’intérêt sont magnétisées
29
Quel est l’avantage de la purification à l’aide d’un aimant et de billes magnétiques par rapport au FACS?
Cette technique permet de purifier un plus grand nombre de cellules rapidement. La méthode du FACS trie une cellule à la fois tandis que cette méthode permet de trier un plus grand nombre de cellules en même temps.
30
Qu’est-ce que la culture cellulaire? Pourquoi est-ce utile? Quelles sont les différentes façons de faire?
La plupart des cellules dissociées de tissus peuvent pousser dans un environnement-milieu approprié supplémenté avec 10% de sérum (veau, veau foetal...) et des facteurs de croissance. On les manipule de façon stérile et on les conserve dans un incubateur à 37oC et 5% CO2. On les congèle en présence de DMSO (cryo-préservateur) et on les conserve dans l’azote liquide (-196oC).
Utile pour les manipulations génétiques et pour tester différentes substances (drogues, hormones ou facteurs de croissance, virus, radiations...).
La culture de cellules est parfois dite faite «in vitro» (en dehors de l’organisme), alors qu’ «in vivo» veut dire dans l’organisme intact.
En biochimie, «in vitro» signifie dans du verre ou dans des tubes en absence de cellules vivantes versus «in vivo» fait dans des cellules en culture.
31
Comment les cellules poussent-elles en culture cellulaire?
Les cellules ne poussent généralement pas en suspension (sauf les cellules sanguines). Elles requièrent une surface solide qui sont des boîtes de culture en plastique traité spécialement (polystyrène hydrophobe → après traitement chargé +).
32
Qu’est-ce qu’une culture de cellule primaire? Comment on peut créer une culture secondaire avec une culture primaire?
Ce sont des cellules isolées directement des tissus (incluant le sang).
Lorsque les cellules arrivent à confluence, on les décolle avec de la trypsine, puis on les dilue et on les recultive. On arrive à une culture secondaire lorsque les cellules sont diluées et ne proviennent plus directement de la source primaire.
La culture secondaire correspond à la culture de cellules primaires qui sont utilisées pour ensemencer d’autres cultures et ainsi de suite.
33
Combien de temps durent les cultures secondaires ?
Des semaines et quelques mois.
34
Quels sont les avantages des cultures de cellules? Donnez des exemples.
Elles conservent beaucoup les propriétés du tissu d’origine. Par exemple, les fibroblastes forment du collagène, les cellules nerveuse forment des axones, les lymphocytes peuvent être stimulés par des antigènes.
35
Quel est l’inconvénient principal des cultures cellulaires primaires? Pourquoi cela arrive? Quelle est la solution?
Les cultures primaires finissent par mourir. Par exemple, les fibroblastes vont être cultivés 25 à 40 passages seulement en raison d’une sénescence réplicative provoquée par:
1. Le raccourcissement des télomères: absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines.
2. Choc de culture: il va y avoir activation d’un mécanisme de contrôle du cycle cellulaire. Cela empêche les cellules de continuer à pousser.
Solution : On peut immortaliser des cellules et générer des lignées cellulaires.
36
Comment est-il possible d’immortaliser des cellules?
1. En réintroduisant la télomérase.
2. En inactivant les contrôles du cycle cellulaire par l’introduction d’oncogènes (T du virus SV40, E6/E7 du virus du papillome humain).
3. Avec des produits chimiques.
4. Le choc de culture peut-être évité suite à une mutation durant la culture (fibroblastes de souris NIH-3T3). Dans ce cas, ce sont les cellules qui s’immortalisent elles-mêmes.
37
Comment les phénomènes de sénescence réplicative et de choc de culture contribuent à la mort des cellules en culture primaire?
L’absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines entraîne le raccourcissement de la séquence de l’ADN ce qui entraîne le vieillissement des cellules.
Le mécanisme de contrôle du cycle cellulaire est activé par le choc de culture ce qui induit l’apoptose et donc la mort des cellules.
38
Que sont des cellules transformées? Quelles sont leurs propriétés?
Ce sont des cellules dérivées de tumeurs, produites en introduisant des oncogènes ou infectées par des virus oncogéniques.
Propriétés: immortelles, prolifèrent à haute densité, pas besoin d’être attachées pour pousser, produisent des tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.
39
Quelle a été la première lignée cellulaire isolée?
HeLa est la première lignée cellulaire isolée (1951) d’une patiente (Henrietta Lack) atteinte d’un cancer de l’utérus. On estime que 10 à 20% des lignées cellulaires des laboratoires sont contaminées par des HeLa.
40
Quelles sont les différences entre les lignées cellulaires non-transformées et transformées?
Lignées cellulaires non transformées: obtenues en immortalisant des cellules en cultures primaires. Ces cellules ne produisent pas de tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.
Lignées cellulaires transformées: dérivées de tumeurs (ou générées par l’introduction de certains oncogènes dans des cellules primaires). Immortelles et produisent des tumeurs lorsqu’injectées dans des souris immunodéficientes.
41
Qu’est-ce que la transfection? Pourquoi est-elle utilisée?
La transfection est le procédé par lequel on introduit un acide nucléique (ADN ou ARN) dans des cellules animales en utilisant des méthodes chimiques, physiques ou biologiques (virus). La transfection est utilisée pour étudier la fonction et la régulation des gènes et pour produire des organismes transgéniques.
42
Qu’est-ce qui fait varier l’efficacité des transfections? Quelles cellules sont plus faciles à transfecter?
L’efficacité va varier en fonction des types cellulaires (les cellules primaires sont en général plus difficiles à transfecter) et de la méthode de transfection.
43
Comment expliquer les méthodes chimiques de transfection?
C’est de faire rentrer dans une cellule des molécules chargées négativement dans une cellule qui possède une membrane cellulaire chargée négativement.
Pour ce faire, il faut neutraliser ou charger positivement l’ADN en le complexant avec du calcium phosphate ou des polycations (rentre par endocytose) ou des lipides pour former des liposomes (rentre par endocytose ou fusion avec la membrane plasmique).
44
Comment expliquer les méthodes physiques de transfection?
La microinjection (cellules ES) ou l’électroporation (les cellules et l’ADN sont mis dans une cuve qui produit un champs électrique qui permet la création de pores dans la membrane plasmique pour permettre à l’ADN de rentrer).
45
Qu’est-ce qu’une transfection transitoire? Quand est-ce que l’expression du gène est la plus importante?
Le plasmide va rentrer dans le noyau où le gène étudié sera transcrit puis traduit.
Le gène d’intérêt ne parvient pas à intégrer le génome de l’hôte et s’exprime temporairement dans l’hôte jusqu’à la division cellulaire puisqu’il n’est pas capable de se répliquer. Expression élevée pour une période de temps limitée. L’expression maximum sera atteinte 48-72 h post transfection (peut être détecté 1 à 8 jours après transfection). Le plasmide sera ensuite dégradé et dilué lors des divisions cellulaires.
46
Quel type d’ADN entre le plus facilement dans les cellules?
L’ADN super enroulé rentre plus facilement dans les cellules (plus compacte).
47
Qu’est-ce qu’une transfection stable? Qu’est-ce que cela nécessite pour fonctionner? Comment on fait pour savoir que cela a fonctionné?
Cela nécessite l’intégration d’ADN du plasmide dans le génome de la cellule, mais c’est un évènement rare (l’ADN du plasmide devra se briser pour s’intégrer).
Il va falloir utiliser un gène de sélection qui permettra la sélection des cellules en présence d’une drogue. on va pouvoir savoir quelles cellules ont eu une transfection stable. Ex: avec 2 millions de cellules 293T, on va obtenir seulement 200 clones (0,01%) stables avec 50% de cellules transfectées.
Si la transfection est transitoire, le gène de résistance s’exprimera de façon transitoire et il y aura donc une résistance à la drogue transitoire. Les cellules résistantes à long-terme auront intégré le plasmide qui sera transmis aux cellules filles après division cellulaire.
Le gène de sélection pourra être porté par le même plasmide ou par un plasmide différent (co- transfection). Dans le cas de la co-transfection le plasmide qui codera pour la protéine étudiée sera en excès pour augmenter la probabilité que les cellules sélectionnées contiennent les 2 plasmides.
48
Quel type d’ADN rend la transfection stable plus efficace?
Lorsque l’ADN est linéaire.
49
Qu’est-ce que le clonage? Pourquoi l’utiliser?
Le clonage (mettre une cellule/puit) sera nécessaire si on veut que 100% des cellules expriment le gène étudié. Si la protéine est exprimée à la surface on pourra utiliser le FACS pour trier les cellules.
50
Quelles sont les méthodes biologiques de transfection? Comment caractériser l’efficacité?
virus recombinants dérivés de l’adénovirus (ADV), du virus adéno- associé (AAV), du γ-rétrovirus (RV) et du lentivirus (LV). Plus efficace que les méthodes chimiques/physiques. Les virus iront directement injecter leur ADN dans le noyau de la cellule.
51
Quelles sont les différences entre transfection, transformation et transduction?
Transfection: introduction de matériel génétique dans des cellules de mammifère.
Transformation: introduction de manière non viral d’ADN dans des bactéries, des cellules eukaryotes non-animal et des cellules de plantes. Également, comme vu précédemment ce terme désigne le mécanisme par lequel une cellule animale devient tumorale.
Transduction: transfection en utilisant un vecteur viral.
52
Que sont les anticorps?
Les anticorps ou immunoglobulines sont des protéines produites par les lymphocytes B en réponse à une molécule étrangère ou un microorganisme (antigène).
53
Chez qui existent les anticorps?
Ils existent chez tous les organismes qui possèdent un système immunitaire.
54
Que va entraîner la liaison de l’anticorps avec l’antigène?
La liaison va l’inactiver où le marquer pour en faire une cible par d’autres composantes du système immunitaire.
Ex:
1-Un Ac va se fixer sur la protéine d’un virus qui normalement reconnait son récepteur et donc bloquer l’infection.
2-Un Ac fixé à un antigène exprimé à la surface d’une cellule tumorale pourra être lysé par une cellule NK («natural killer») ou un macrophage.
55
Qu’est-ce qu’un antigène?
C’est une molécule contre laquelle se développe des anticorps.
56
Qu’est-ce qu’un épitope? À quoi correspond-il?
C’est une région spécifique sur l’antigène reconnue par un anticorps.
Dans le cas d’une protéine, un épitope correspond en général à environ 5-6 acides aminés.
Donc pour une protéine de 150 aa, il existerait en théorie au moins 30 différents épitopes potentiels et autant de populations d’anticorps et de populations différentes de lymphocytes B.
57
Chaque population d’anticorps est générée par quoi?
Chaque population d’anticorps est générée par une population distincte homogène de lymphocytes B.
58
Vrai ou faux? Une molécule pourra être plus ou moins antigénique selon sa composition ou sa structure.
Vrai.
59
Vrai ou faux? Un antigène peut seulement générer un anticorps.
Faux. Un antigène peut générer différents anticorps qui reconnaîtront des épitopes spécifiques.
60
Quelles sont les différences entre les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux?
Polyclonaux : c’est un mélange d’anticorps qui reconnaissent plusieurs épitopes d’un même antigène. Ils se retrouvent dans le sérum avec d’autres anticorps. Chaque population est en quantité limitée.
Monoclonaux : reconnaissent un seul épitope (hautement spécifique). A valu un prix Nobel à ses découvreurs Milstein et Khöler.
61
Comment se fait le choix de l’espèce animal pour la production d’anticorps?
C’est une question de pratique seulement.
62
Qu’est-ce qu’un hybridome? Quel est leur fonction?
C’est une cellule provenant de l’hybridation artificielle de cellules lymphoïdes normales et de cellules cancéreuses.
L’hybridome cumule les propriétés des deux cellules de départ : production d’anticorps et immortalité. Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices d’anticorps monoclonaux.
63
Quel est le processus de production des hybridomes?
On produit des cellules hybridomes à partir de lymphocytes provenant de souris immunisées contre l’antigène d’intérêt.
1. L’antigène est injecté dans une souris pour que celle-ci produise des anticorps spécifiques.
2. La rate est prélevée
3. Les cellules cancéreuses de souris sont prélevées et fusionnés avec les lymphocytes producteurs d’anticorps grâce au polyéthylène glycol ce qui forme des hétérocaryon.
4. Les cellules sont ensuite mise dans un milieu de culture sélectif qui permettra seulement aux cellules hybrides de survivre et de se reproduire pour former des clones.
5. Identification des clones positifs en détectant l’anticorps dans le surnageant.
64
Expliquez les grandes étapes du fractionnement cellulaire.
1. Briser les cellules par choc osmotique, vibration ultrasonique (sonicateur), broyage avec un mixer.
2. La suspension cellulaire maintenant réduite en lysat/homogénisat mais où les organites restent intactes.
3. Séparation des différents éléments.
65
Quelle est le principe de centrifugation différentielle? Quels sont les éléments qui se retrouvent au fond?
C’est la séparation avec une ultracentrifugeuse selon la taille et la densité des composants. Elle permet de séparer des particules de dimensions très différentes.
Les éléments les plus lourds se retrouvent au fond, dans le culot.
Plus on augmente la vitesse, plus le culot contiendra des petites composantes.
Basse vitesse : cellules, noyau
Moyenne vitesse : mitochondries, lysosome, etc…
66
Qu’est-ce que le fractionnement cellulaire? Qu’est-ce que cette technique permet? Quels sont les 2 types de sédimentation?
Une meilleure séparation est obtenue en appliquant l’homogénat sur le dessus d’une solution de sel qui remplie le tube et un gradient de concentration de solutions de sucrose.
1. Sédimentation de vitesse: permet une séparation selon la taille et la forme ou coefficient de sédimentation (valeur S).
2. Sédimentation à l’équilibre: permet une séparation selon la densité de flottaison (buoyant-density), indépendamment de la taille et de la forme. Fct de la densité du composant.
La séparation se fait en une série de bandes en fonction des vitesses.
67
Qu’est-ce qu’une immunoprécipitation? Quel est le fonctionnement?
C’est une technique qui permet la précipitation d’un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement cette protéine.
1. On incube notre échantillon avec l’anticorps qui va se lier avec la protéine d’intérêt
2. On ajoute des protéines A ou G qui vont aussi se lier à l’anticorps
3. On centrifuge
4. La grosseur des protéines A ou G font en sorte qu’elle se retrouvent dans le fond du tube entraînant aussi l’anticorps et la protéine d’intérêt.
68
Qu’est-ce qu’une co-immunoprécipitation?
C’est le même principe que l’immunoprécipitation sauf qu’on veut isoler un complexe protéique. L’anticorps qui sera choisi va lier seulement une des protéines du complexe mais va quand même permettre de précipiter le complexe au complet.
69
Quelles sont les applications de l’IP?
1. Isoler des protéines d’interêt
2. Enrichissement de protéines peu abondantes
3. Étude des interactions entre les protéines et les complexes de protéines
4. Identifier des protéines inconnues dans un complexe protéique
5. Vérifier l’expression d’une protéine dans un tissu spécifique
70
Expliquez le principe d’un western blot.
Bin la
71
Quelles sont les différences entre des cellules totipotentes, pluripotentes, multipotente et des cellules souches?
Totipotente (embryon précoce): peut se différencier en tous les types cellulaires, embryonnaires et extra-embryonnaires (placenta et cordon ombilical).
Pluripotente: potentiel de différenciation plus faible que les cellules totipotentes mais peut redonner tous les types cellulaires et un organisme en entier. Ne peuvent pas former le placenta ni le cordon ombellical.
Multipotente: potentiel de se différencier en différents types cellulaires à l’intérieur d’une lignée spécifique. (cellules souches hématopoïétiques en leucocytes et érythrocytes)
Cellules souches: cellules non spécialisées totipotentes/pluripotentes/multipotentes (adultes et embryonnaires) desquelles dérivent des cellules spécialisées. Les cellules ES et iPS (pluripotentes): réintroduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires.
72
Qu’est-ce que la différenciation cellulaire, la transdifférenciation, la dédifférenciation et la re programmation cellulaire?
Différenciation cellulaire: le processus par lequel les cellules se spécialisent en un « type » cellulaire.
Transdifférenciation: une cellule qui se différencie à partir d’une autre cellule différenciée sans passer par l’étape cellule souche.
Dédifférenciation: une cellule complètement différenciée retourne dans un état moins différencié.
Reprogrammation nucléaire: restaure sa pluripotentialité et le plein potentiel à se différencier dans tous les types cellulaires.
73
Que sont les cellules souches? Comment se répliquent-elles? Où se retrouvent-elles?
Ce sont des cellules non spécialisées (adultes et embryonnaires) desquelles dérivent toutes les cellules spécialisées.
Chaque cellule fille issue de la division d’une cellule souche peut soit rester une cellule souche soit se différencier.
Se retrouvent en petit nombre dans presque tous les tissus (intestin, peau...).
74
Quelles sont les caractéristiques des cellules souches embryonnaires (ES)? Comment prolifèrent-elles?
Proviennent du bouton embryonnaire ou masse cellulaire interne («inner cell mass, ICM») de l’embryon.
Prolifèrent indéfiniment en culture sans oncogene.
Sont pluripotentes: conservent leur potentiel de différenciation.
Ré-introduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires (adaptent leur phénotype à celui des cellules du site d’intégration).
75
Quel est le potentiel en médecine pour de la thérapie cellulaire avec les cellules ES?
On peut en induire la différenciation avec diverses hormones ou facteurs de croissance. Il y a donc un potentiel pour remplacer et réparer tissus malades.
Muscles: dystrophie musculaire.
Cellules nerveuses: parkinson.
Cellules de Langherans (insuline): diabète.
76
Quels sont les 2 problèmes avec les cellules ES? Quelle est la solution?
1. Une greffe qui provient d’ailleurs va nécessiter l’utilisation d’immunosuppresseurs pour éviter le rejet.
2. Problème éthique, on ne peut pas prélever des cellules ES humaines.
Solution : la re programmation nucléaire.
77
Est-ce que les cellules d’un organisme adulte sont génétiquement identiques à l’oeuf fertilisé duquel elles dérivent? Comment peut-on en être sûr?
Briggs and King au début des années 50 suggéraient que le matériel génétique est irréversiblement altéré dès que les cellules commencent à se différencier. Cependant, Briggs et d’autres ont montré que ce n’était pas le cas.
En effet, en transférant les noyaux de cellules adultes différenciées dans des oeufs énucléés, on obtient des grenouilles adultes clonées. Cela est la preuve que tout le matériel génétique se retrouve dans une seule cellule.
78
Qu’est-ce que la reprogrammation nucléaire?
Des cellules somatiques différenciées peuvent être reprogrammées vers un état embryonnaire (pluripotent) en transférant leur noyau dans des oocytes.
79
Quelles sont les étapes de la reprogrammation nucléaire?
1. Prélever des cellules différenciées (ex : des cellules épithéliales)
2. Injecter ces cellules dans un œuf sans noyau.
3. On peut faire des transferts en série mais on obtiendera un organisme pareil comme celui dont nous avons prélevé la cellule épithéliale.
80
Expliquez le principe du clonage reproductif chez le bovin.
Un noyau prélevé d’une cellule différenciée chez une vache adulte et introduit dans un œuf énucléé d’une autre vache produira un veau qui aura le même matériel génétique que la vache donneuse de cellule différenciée.
81
Que se passe-t-il avec l’expression des gènes dans la reprogrammation nucléaire?
Des gènes silencieux dans des cellules différenciées peuvent ainsi être réactivés.
L’expression des gènes dans les cellules différenciées demeure dynamique et réversible.
82
Qu’est-ce qui n’est pas éthique dans la reprogrammation nucléaire?
l’obtention de cellules pluripotentes requiert des ovules pour la reprogrammation ce qui est éthiquement pas acceptable.
83
Que sont les cellules iPS (induced pluripotent stem cells)? Qu’est-ce qu’elles peuvent donner?
Ce sont des cellules pluripotentes produites à partir de cellules somatiques isolées de tissus adultes. Ré-introduites dans l’embryon, elles redonnent tous les types cellulaires.
84
En quoi les cellules ES sont-elles différentes des cellules iPS et pourquoi ont-elles transformé les disciplines de la biologie développementale et de la médecine régénérative?
Les deux types de cellules sont pluripotentes, ce qui veut dire qu'elles ont la capacité de se différencier en presque tous les types cellulaires. La différence entre les deux types de cellules provient de l'origine de ceux-ci.
Les cellules ES proviennent du bouton embryonnaire, ce qui veut dire qu'une culture de cellules ES est une culture de cellules ne s'étant jamais différenciées.
Les cellules iPS sont des cellules différenciées ayant subient une dédifférentiation pour redevenir pluripotentes. Ces cellules peuvent provenir de plusieurs tissus somatiques adultes différents.
Au final, les cellules iPS sont ainsi plus "simple" à obtenir que les cellules ES, qui demandent des ovules.
Une différence importante serait si on veut utiliser ces cellules en thérapie cellulaire. En effet, les cellules greffées (différentiées) à partir d’iPS serait autologue (et donc pas de rejet de greffe possible) alors que les cellules provenant des cellules ES seraient allogéniques.
85
Comment sont obtenues les cellules iPS?
En 2006, Takahashi et Yamanaka, produisirent les 1ères cellules souches, semblables aux cellules ES, en introduisant dans des MEF les gènes codant pour les facteurs de transcription, Oct4, Sox2, Klf4 et
c-Myc, et appelèrent ces cellules des cellules souches induites pluripotentes (iPS).
1. À partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ou du derme humain adulte on obtient des cellules somatiques différenciées.
2. Introduire des gènes spécifiques aux cellules ES (facteurs iPS) dans les cellules avec des vecteurs rétroviraux. Les cellules rouges = cellules exprimant les gènes exogènes.
3. Sélection propre aux cellules ES.
4. Obtention de cellules semblables aux cellules ES = cellules iPS.
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Comment les cellules iPS peuvent être utiles pour guérir des maladies?
Reprogramation de fibroblastes provenant de souris souffrant d’anémie drépanocytaire (« sickle-cell anemia ») en cellules iPS.
• Correction de la mutation par la technique de remplacement de gènes.
• Différenciation de ces cellules en cellules souches hématopoïétiques.
• Transplantation dans les souris malades et guérison des souris.
On a utilisé des cellules de la peau pour guérir une maladie qui affecte les cellules du sang, et on a pas besoin d’immunosuppresseurs!
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Quelles sont les 2 approches de thérapies génétique utilisant les cellules iPS?
Utilisé pour l’identification de nouveaux médicaments.
Correction par thérapie génique (addition ou édition génique).
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Quelles sont les différences entre la génétique classique et la génétique inverse?
Génétique classique: à partir d’un phénotype mutant on va identifier la mutation et le gène correspondant.
Génétique inverse: la technologie de l’ADN recombinant permet une approche inverse:
– Identifier le phénotype associé à un gène dont on ignore la fonction.
– En générant des cellules ou des organismes (souris) dans lesquels le gène d’intérêt a été muté.
On mute un gène pour voir ce que ça fait et ensuite on peut savoir la fonction du gène.
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Quels sont les 3 problèmes potentiels aux cellules iPS?
1. Utilisation des vecteurs rétroviraux ont été remplacés par des vecteurs non-intégratifs (expression transitoire des facteurs de transcription suffisante).
Explication : l'utilisation de virus comme moyen d'introduction des facteurs de reprogrammation dans la cellule présente des risques. En effet, l’ADN viral peut s'introduire dans celui de la cellule hôte provoquant des mutations génétiques chez cette dernière. Des efforts ont donc été entrepris pour développer des techniques ne nécessitant pas l'utilisation des vecteurs viraux. C'est ainsi que des équipes sont parvenues à induire la pluripotence en délivrant les différents facteurs sous la forme de protéines recombinantes ou d'ARNm28,29. Mais l'efficacité de ces deux techniques est très faible comparativement à l'approche virale et nécessite donc d’être optimisée. L’utilisation de vecteurs Sendai (vecteur viral ARN non intégratif) permet une très grande efficacité et évite la problématique de l’insertion des facteurs de reprogrammation tout en permettant une reprogrammation très efficace, y compris à partir de cellules sanguines.
2. Les facteurs iPS ont eux-mêmes un potentiel oncogénique. Donc, les cellules iPS dérivées de cette manière sont utile: pour l’étude des mécanismes des maladies, pour le criblage de médicaments, mais elles ne semblent pas appropriées pour la thérapie cellulaire.
3. De plus, il existe une variabilité intrinsèque dans le potentiel de différenciation des différentes lignées de cellules iPS. Le phénotype des cellules obtenues de sous-cultures n’est pas nécessairement relié spécifiquement à la cellule affectée dans la maladie étudiée.
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Quelle est la différence entre un clonage reproductif et un clonage thérapeutique?
Le clonage reproductif correspond à la méthode reproductrice artificiellement pratiquée afin de cloner un ou plusieurs êtres vivants qui posséderont un patrimoine génétique identique à leur donner.
Le clonage thérapeutique est une technique de production de matériel vivant via l’injection de cellules couches de la moelle osseuse pour remplacer un organe détruit et dont la compatibilité est assurée avec le patient. Il ne vise qu’à produire des cellules à des fins médicales.
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Qu’est-ce qu’un organisme transgénique?
Tout animal ou toute plante modifiée génétiquement par la délétion, l’addition ou le remplacement d’un gène est dit «transgénique».
Tout gène modifié ou ajouté est appelé «transgène».
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Qu’est-ce qui arrive lorsqu’on pratique la génétique inverse? Quels sont les différents types de mutants?
Il y a délétion du gène d’intérêt par ciblage génique «gene targeting». Inactivation génique chez la souris (gene knock out «KO» ou souris KO).
Différents types de mutants:
1. KO total (les 2 allèles, si non létal).
2. KO spécifique à certains tissus ou à un moment particulier. Le système Cre-Lox : permet un KO spécifique dans un tissu ou type cellulaire particulier (Fig. 5-66 plus texte associé).
3. Mutant ponctuel sur certains AA spécifiques ou certaines régions (modèle de maladie génétique).
4. Remplacement de gène: fusion du gène avec le gène qui code pour la GFP qui permet de suivre son expression in vivo.
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Quel est le processus du ciblage génique chez la souris par recombinaison homologue?
1. Introduction dans des cellules ES d’ADN modifié contenant des séquences d’homologie avec le gène ciblé qui pourra mener à une recombinaison homologue.
2. Un ADN transféré dans une cellule ES peut s’insérer dans un chromosome au hasard.
3. 1/1000 cet ADN remplacera une copie du gène homologue par recombinaison homologue.
4. Les cellules dans lesquelles cela se produit seront sélectionnées.
5. N’importe quel gène peut être ciblé et ainsi modifié ou inactivé.
6. Dans le cas où les 2 copies du gène sont inactivées, l’animal qui en résulte est appelé «souris invalidée» ou «knock-out» (KO).
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Comment sont inactivés les gènes chez les souris? Comment les souris KO sont produites?
Une version modifiée du gène est introduite dans des cellules ES par recombinaison homologue.
Sélection des rares clones formés de cellules portant le gène altéré inséré par recombinaison.
Injection des cellules mutées dans des blastocystes.
Incorporation du gène muté dans la souris adulte (mosaïque).
Croissement avec une souris normale et obtention de souris portant une copie du gène modifié dans toutes ses cellules (KO si délétion).
Le croisement de 2 souris modifiées donnera 1⁄4 des descendants homozygotes.
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Comment est-il possible de sélectionner les cellules ES qui ont eu une recombinaison homologue et non une intégration aléatoire?
Lors d’une recombinaison homologue, il faut que le gène d’intérêt aille une séquence homologue avec la séquence d’ADN avec laquelle il va faire la recombinaison. Si la recombinaison fonctionne, la cellule va être résistante à quelque chose. Par exemple, le gène Néor est résistant au G418.
S’il y a une intégration aléatoire, ce ne sera pas seulement le gène d’intérêt qui aura intégré l’ADN mais bien tout ce qui vient avec. Par exemple, Néor et HSV-TK. Bien que Néor est résistant à G418, HSV-TK a une faiblesse pour GCV.
Pour déterminer quelles sont les cellules qui ont eu une recombinaison homologue, il faut les mettre en présence de G418 et de GCV. Les cellules ayant eu une recombinaison homologue survivront et les cellules ayant eu une recombinaison aléatoire seront tuées par le GCV.
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Comment expliquer le système Cre-Lox chez la souris?
Insertion de 2 type d’ADN dans les cellules germinales dans 2 souris.
1. La recombinase Cre du bactériophage P1, sous le contrôle d’un promoteur spécifique à un tissu en particulier ou actif seulement durant une période spécifique du développement. Cela forme une souris transgénique.
2. Le gène d’intérêt qu’on désire supprimer, flanqué des sites de reconnaissance (LoxP) pour la recombinase: remplacement du gène endogène.
Croisement des souris: si la recombinase est exprimée dans le foie seulement, le gène d’intérêt sera supprimé uniquement dans le foie.
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Comment l’interférence par l’ARN (RNAi) est une façon rapide d’étudier la fonction d’un gène? Quel est le fonctionnement? Quels sont les désavantages?
1. Des ARN interférents sont produits à partir d’ARNdb.
2. Ils localisent leur ARN cible par appariement de bases.
3. Inhibition de la traduction et/ou destruction de l’ARN.
Interférence par l’ARN chez les eucaryotes: introduction dans une cellule ou un organisme de l’ARNdb dont la séquence nucléotidique est complémentaire à une région d’un gène qu’on veut inactiver.
Une fois l’ARN traité dans la cellule, il s’hybride avec l’ARN du gène cible et réduit son expression.
Facilite la génétique inverse, mais comporte des limitations vs un KO complet car inactive pas de façon efficace tous les gènes. Certains tissus sont résistants.
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Vrai ou faux? KO par recombinaison homologue dans cellules ES est très efficace.
Faux. C’est très PEU efficace.
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Des chercheurs ont montré qu’une cassure double brin augmente l’efficacité de la recombinaison homologue. Comment peut-on créer une cassure double brin à un endroit spécifique dans le génome?
Les ZFN et TALEN sont des protéines fusionnées au domaine nucléasique FokI alors que CRISPR est un assemblage nucléo- protéique contenant un ARN et la nucléase Cas9.
Ces 3 systèmes sont capable d’induire des coupures double brin dans l’ADN de façon séquence spécifique.
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Quel est le processus de fonctionnement des doigts de zinc (ZFN)? Qu’est-ce qui limite leur utilisation?
Ces protéines artificielles sont composées de peptides dits à doigts de zinc, qui reconnaissent une séquence d’ADN, et d’une nucléase (FokI) qui coupe l’ADN. Chaque peptide à doigt de zinc reconnaît une courte séquence de trois nucléotides : l’assemblage de plusieurs d’entre eux permet de cibler des séquences plus longues, de manière plus spécifique. En outre, pour couper, les nucléases à doigt de zinc agissent à deux, sur deux sites proches l’un de l’autre. Cela permet une action catalytique des enzymes FokI. Une modification génomique nécessite donc deux nucléases à doigts de zinc, dont la construction et l’assemblage sont très complexes. Cela limite leur utilisation.
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Quel est le processus du système TALEN?
Les TALENs (pour Transcription Activator Like-Effectors) sont également utilisés par paires, ciblant deux séquences d’ADN proches. Ils comprennent un domaine de fixation à l’ADN composé d’une combinaison de quatre peptides, chacun de ces peptides reconnaissant spécifiquement une des quatre bases de l’ADN. En jouant sur l’enchainement de ces peptides, il est possible de cibler une séquence d’ADN spécifique. Ce domaine de fixation est associé à une nucléase Fok1 qui assure la coupure double brin.
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D’où sont dérivés les ZNF et les TALEN?
ZFP : dérivés de facteurs de transcription eucaryotes
TALEN : dérivés de la bactérie Xanthomonas
103
Quelle est la procédure de CRSIPR?
Cette fois c’est un ARN guide (CRISPR pour Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), et non une protéine, qui reconnait la séquence cible à couper. Il est associé à une nucléase Cas, le plus souvent Cas9, qui coupe l’ADN à cet endroit précis.
1. Après infection par un virus dans une bactérie, un morceau de l’ADN du virus est inséré dans le locus CRISPR à proximité d’une séquence PAM. Des descendants doivent être créé après cette transfection.
2. De l’ARN est transcrit à partir du locus CRISPR et s’associe avec la protéine Cas9.
3. Lors d’infections subséquente par le virus contre lequel la bactérie a été « immunisée », l’ADN de ce virus sera détruit par un ARN complémentaire associé à la Cas9.
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Comment peut-on utiliser CRISPR pour étudier la fonction des gènes?
Un ARN guide spécifiquement conçu et de la Cas9 vont se lier à une séquence spécifique d’ADN et la couper.
Une portion de l’ARN est requise pour l’association avec la Cas9. Une autre portion est conçue pour reconnaître des séquences dans le génome (ARN guide).
Présence obligatoire de la séquence PAM adjacente à la séquence cible. Requise pour la coupure par la Cas9 (permet à la bactérie de différencier son génome de celui du phage).
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Quels sont les 3 avantages du système CRISPR/Cas9?
1. Plus simple, plus rapide et plus économique que les technologies existantes pour le chercheur (TALEN, ZFN).
2. Adaptée aux approches de criblage de nombreuses cibles.
3. Utilisation de multiples séquences d'ARN de guidage pour modifier simultanément plusieurs locus différents dans un même génome.
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Que se passe-t-il après la cassure double brin (CDB) induite par ZFN, TALEN ou CRISPR?
Il y aura répartition de la cassure.
1. NHEJ (« non homologous end joining ») : Réparation par jonction d’extrémités non homologues. Restaure la continuité de l'ADN endommagé mais introduit des indels: insertions ou délétions (ne restaure pas la séquence initiale). Utilisée pour inactiver des gènes.
2. HDR (« homology-directed repair ») : Réparation par recombinaison homologue. Inclusion d’ADN homologue utilisée lors de la réparation. Utilisée pour modifier le génome avec précision ou pour insérer de l’ADN exogène.
L’inactivation d’un gène de façon classique se fait par recombinaison homologue alors que cela n’est pas nécessaire après coupure d’ADN.
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Résumez les systèmes de ZFN, TALEN et CRISPR.
Une nucléase introduite dans la cellule va cibler une séquence d’ADN spécifique afin d’y introduire une cassure double brin (CDB).
Les mécanismes intracellulaires de réparation de l’ADN seront activés.
Les CDB sont réparées par NHEJ ou par HDR.
• NHEJ: les 2 extrémités de la cassure sont rattachées ensemble. Durant ce processus quelques nucléotides sont occasionnellement insérés ou supprimés au hasard => formation d’un produit tronqué.
• HDR: fait intervenir des séquence homologues qui servent de gabarit pour la réparation de la CDB. Des mutations ou des segments d’ADN exogènes peuvent être incorporés en fournissant à la cellules un gabarit d’ADN qui possède une homologie avec les séquences adjacentes à la CDB.
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Comment on peut utiliser CRISPR pour étudier la fonction des gènes?
1. Utilise pour faire du remplacement de gène avec un gène muté, en fournissant l’ADN gabarit en trans.
2. Utilisation d’une protéine Cas9 mutante dépourvue d’activité nucléaire et fusionnée à des domaines protéiques d’activation ou d’inhibition de la transcription pour activer ou réprimer des gènes.
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Expliquez l’utilisation du système CRISPR/Cas9 dans du criblage à haut débit.
Le vecteur lentiviral va exprimer une librairie d’ARN guide et la Cas9 dans une lignée de cellules tumorales. Les cellules non infectées seront éliminées par la puromycine. Les cellules seront traitées avec une drogue anticancéreuse, puis les vecteurs-guides seront identifiés dans les populations cellulaire. Cela mène à la création de thérapies médicamenteuses.
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Comment introduire le système CRISPR/Cas9 dans les cellules?
Transfection de plasmides (2 plasmides ou 1 plasmide: ARN guide + Cas9).
Vecteurs viraux intégratifs ou non-intégratifs.
Transfection de Cas9 mRNA et de gRNA.
Transfection d’un complexe ribo-nucléoprotéique (gRNA + Cas9 protein).
Expression transitoire est suffisante et préférable (expression continue de Cas9 et de gRNA va augmenter les coupures hors site.
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Comment on peut utiliser le système CRISPR/Cas9 pour générer des souris KO? Quels sont les avantages?
On effectue une injection directement dans l’œuf fertilisé (même stratégie que pour générer une souris transgénique).
Gain de temps important et plus besoin de passer par les cellules ES. On peut obtenir un double KO facilement et rapidement.
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Comment on peut générer des souris transgénique versus des souris KO?
Transgénique : l’ADN d’une femelle donneuse st injecté dans un oocyte fertilisé. Formation d’un embryon implanté dans une femelle.
KO : l’ADN comportant le transgène est intégré dans des cellules ES. Les cellules ayant subit une transfection stable sont sélectionnées et injectées dans un embryon. Celui-ci est implanté dans une femelle. Le bébé de cette femelle est accouplé à une souris WT. On sélectionne les souris homozygotes descendantes de ces deux souris.
113
Quels sont les problèmes de création d’une souris transgénique? Quelle est la solution?
L’ADN va s’intégrer au hasard dans un petit % d’oocytes. Il pourrait s’intégrer dans un locus important ou dans un endroit sujet à methylation.
Approche avec endonucléase : la modification est ciblée. Il peut y avoir des coupures hors cible. Cette approche est beaucoup plus courte qu’en passant par les cellules ES.
114
Que sont ZFN, TALEN et CRISPR? Comment sont-ils fabriqués?
Ce sont des méthodes d’édition du génome. Ils sont fabriqués in-vitro et vont cibler une séquence d’ADN spécifique afin d’y introduire une cassure double brin.
115
Quelle est la limitation incontournable pour tout microscope? Quelle est la limite de résolution des MO?
Pour une radiation donnée, aucun détail structural plus petit que sa longueur d’onde ne peut être résolu.
La limite de résolution d’un microscope optique (MO) est déterminée par la longueur d’onde de la lumière visible = 0,4 μm (violet) à 0,7 μm (rouge). Bactéries et mitochondries (0,5 μm) sont les plus petits éléments qui peuvent être discernées en MO.
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Qu’est-ce que la limite de résolution?
La distance minimale à laquelle 2 objets apparaissent distincts. Dans le meilleurs des cas, avec une lumière violette, et un excellent microscope = 0,2 μm.
117
Quelle est la différence entre résolution et détection?
Un petit objet en deçà de la limite de résolution peut être détecté s’il émet de la lumière.
118
Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence?
Les molécules fluorescentes absorbent la lumière à une longueur d’onde (λ) spécifique et en émettent à une λ différente.
Si on illumine une telle molécule à sa λ d’absorption puis qu’on la visualise à travers un filtre qui ne fait passer que la lumière de λ d’émission, elle rayonnera sur un fond noir.
Permet de visualiser des molécules fluorescentes endogènes (GFP) et exogènes (Ac couplé à une molécule fluorescente ou molécule s’intercalant dans l’ADN comme le DAPI).
119
Que sont des sondes fluorescentes et fluorochromes? Comment est-ce utilisé?
Substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur d’onde.
Une méthode très utilisée consiste à coupler un fluorochrome à un anticorps. En couplant différents Ac à différents fluorochromes, on peut détecter différentes molécules dans la même cellule.
Méthode moderne de choix pour l’étude de la physiologie cellulaire: peut permettre l’observation des cellules vivantes (GFP, «green fluorescent protein» isolé de méduse) et de visualiser des structures.
120
Quelles sont les différences entre immunocytochimie, immunohistochimie et immunofluorescence?
Immunocytochimie (cellule) immunohistochimie (tissus): Méthode de détection d’un antigène à l’aide d’un Ac couplé à une enzyme ou un fluorochrome.
Immunofluorescence: L’Ac est lié à un fluorochrome permettant de visualiser et/ou quantifier l’antigène cible. L’immunofluorescence est un type d’immunohistochimie.
121
Qu’est-ce que l’immunofluorescence indirecte?
Les Ac sont utilisés pour détecter des antigènes spécifiques. Un Ac secondaire couplé à un fluorochrome (immunofluorescence indirecte) pourra être utilisé pour amplifier le signal ou si l’Ac primaire marqué n’est pas disponible. Il se fixera à l’Ac primaire.
Ac primaire: anti-souris reconnaitra l’antigène (espèce étudiée) produit dans le lapin.
Ac secondaire: anti-lapin produit dans la chèvre et dirigé contre l’Ac primaire de lapin et couplé à une molécule fluorescente (détectée par immunofluorescence).
122
Que se passe-t-il si l’anticorps secondaire est polyclonal dans l’immunocytochimie indirecte?
Si l’Ac secondaire est polyclonal, plusieurs Ac marqués vont se fixer sur l’Ac primaire, et donc le signal sera amplifié.
Marqueur = enzyme ou fluorochrome.
123
Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence?
Lorsque des fluorophores sont couplés à des anticorps, il est possible de les visualiser avec de la microscopie à fluorescence.
124
Qu’est-ce que l’hybridation in situ? Comment on peut visualiser?
C’est une méthode de détection des acides nucléiques. On peut détecter des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques. Les sondes sont des ARN ou ADN complémentaires aux séquences d’intérêt. Cela repose sur les principes d’hybridation des acides nucléiques.
C’est appliqué sur des cellules ou des coupes de tissus et visualisé par :
1. Radioautographie grace aux nucleotides radioactifs présents dans la sonde.
2. Immunocytochimie grâce à la présence de nucleotides couples à la digoxigénine, alors détectée par un anticorps spécifique couplé à une enzyme ou à une molécule fluorescente (FISH)
3. Fluorescence grace aux nucleotides marques avec un fluorochrome présents dans la sonde.
125
Comment fonctionne l’autoradiographie dans l’hybridation in situ?
L'autoradiographie est une technique d'imagerie d'émission réalisée à partir d'une source radioactive placée au contact d'une émulsion ou d'un film photographique. La sonde est radioactive.
126
Comment expliquer la méthode FISH dans l’hybridation in situ?
Dans cette méthode, le nucleotide est directement marqué avec un fluorochrome ou à la digoxigénine qui sera reconnu par un Ac couplé à une molecule fluorescente (FISH).
127
Que sont les quantum dots? À quoi servent-ils?
Les fluorochromes organiques perdent leur fluorescence rapidement. De nouveaux fluorochromes: ponts quantiques («quantum dots») sont des nanoparticules (2–10 nM) fait de séléniure de Cd. Fluorescence plus stable dans le temps (semaines) et émettent des couleurs.
128
Quel est le principe de déconvolution d’image dans la microscopie à fluorescence?
Le microscope optique fait le point sur un plan focal donc donne une image en 2 dimensions → image ± flou.
Pour avoir une image en trois dimensions il y a 2 solutions
1. Par ordinateur déconvolution d’image
2. Confocal
129
Qu’est-ce que la microscopie confocale?
Un laser balaye le spécimen dans toute son épaisseur et sa largeur, et concentre le faisceau lumineux sur un point à une profondeur précise du spécimen.
Les données pour chaque point sont rassemblées séquentiellement et les images produites sont enregistrées par un ordinateur. Forme une image composite de l’ensemble de la cellule ou un plan très mince de la cellule.
130
Qu’est-ce que la GFP? Comment est-elle utilisée?
La «Green Fluorescent Protein» (GFP), isolée de la méduse, est fluorescente de façon inhérente. A été cloné en 1992 et utilisée comme étiquette in vivo en 1994.
Des mutations ont permis de générer des variants plus fluorescents et avec des couleurs différentes.
Des protéines isolées d’autres organismes marin sont également utilisées (anémone de mer et autres petits animaux marins).
Les protéines de fusion (en N- ou C-terminal) se comportent très souvent comme la protéine sauvage (vs Ac fluorescent).
Aussi, la GFP est très utilisée comme molécule- rapportrice pour suivre l’expression des gènes: ici embryon transgénique de drosophile vivant contenant la région codante de la GFP qui est exprimée sous le contrôle d’un promoteur actif dans certains neurones.
131
Qu’est-ce qu’on peut utiliser en fusion avec la GFP?
Utilisée aussi en fusion avec un peptide-signal de localisation pour en diriger l'expression vers un organite spécifique et en étudier la distribution et la dynamique.
132
Qu’est-ce qu’un gène rapporteur?
Un gène rapporteur est un gène dont le produit (protéine) possède une caractéristique lui permettant d'être observé en laboratoire (fluorescence, activité enzymatique détectable). Les gènes rapporteurs sont utilisés pour permettre de visualiser ou mesurer l'expression d'un gène d'intérêt, pour cela le gène rapporteur peut être fusionné au gène étudié, ou mis sous le contrôle du promoteur de ce dernier.
133
Qu’est-ce que la luciférase? À quoi ça sert?
La luciférase isolée de la luciole va émettre de la lumière en présence du substrat luciférine que l’on mesurera avec un luminomètre
Permet d’identifier quand et où (quels tissus) un gène est exprimé ou comment sa localisation change en réponse à des stimuli.
134
Que permettent les protéines fluorescentes?
L’utilisation des protéines fluorescentes permet d’étudier les propriétés cinétiques d’une protéine et de déterminer si elle interagit avec d’autres protéines.
135
Quelle est la méthode du FRET? Que permet-elle?
FRET (transfert d’énergie par résonnance en fluorescence): permet de suivre les interactions entre 2 protéines.
1. Protéine X couplée à une GFP excité en violet, émettant en bleu.
2. Protéine Y couplée avec une GFP excité en bleu, émettant en vert.
3. Si X et Y sont suffisamment proches (< 5 nM) suite à une interaction, une excitation en violet produira une émission en vert.
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Qu’est-ce que la photoactivation?
Fait intervenir une forme inactive d’une protéine fluorescente.
Son activation va se faire à un endroit spécifique par un rayon lumineux.
Par exemple, la tubuline marquée avec une fluorescéine peut s’incorporer aux microtubules (MT) du fuseau mitotique après injection dans une cellule en division.
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Qu’est-ce que la FRAP? À quoi ça sert?
C’est la récupération de fluorescence après photonbanchiment.
Éteint la fluorescence de la GFP avec un puissant rayon laser dans une région spécifique. Puis, analyse du déplacement des molécules fluorescentes restantes dans la région blanchie. Donne des information sur la cinétique de la protéine.
Ici blanchiment de l’appareil de Golgi, site de recrutement de la galactosyl transférase. Inhibition de la synthèse de nouvelle molécules avec la cyclohex. Déplacement de molécules fluorescentes du RE vers le Golgi.
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Qu'est-ce que le concept d'ingénierie du génome?
L'ingénierie ciblée du génome humain sert à introduire des modifications spécifiques à l'ADN d'un organisme. Ces « modifications » peuvent être apportées soit aux cellules somatiques ou aux cellules germinales.
