Introduction à la microscopie

Question 1

Décris le principe de la microscopie électronique

Answer 1

Lentilles de verre sont des électro-aimants qui dirigent les électrons à travers l’échantillon le long d’une colonne qui est maintenue sous-vide et les électrons sont ralentis ou bloqués aux endroits les plus denses.

Question 2

Décris le principe de la microscopie à épifluorescence

Answer 2

Source lumineuse émet différentes longueurs d’onde et la fibre d’excitation excite l’échantillon en étant réfracté par un miroir dichroique, qui a été préalablement incubé avec une molécule fluorescente qui réagit avec l’excitation spécifique

Question 3

Décris le principe de MET

Answer 3

Faisceaux d’électrons contrôlés par une lentille électronique. L’écran est sensible à la lumière et si l’électron passe c’est noir et si l’électron ne passe pas, c’est blanc (noir et blanc)

Question 4

Décris le principe de MEB

Answer 4

Quand l’électron frappe l’échantillon, il est recouvert d’un métal qui conduit l’électricité, et les électrons qui rebondissent sont captés par un capteur et analysés électroniquement. Donc l’image est reconstruite par la synthèse des électrons qui ont rebondi sur l’échantillon (pas une image réelle)

Question 5

Vrai ou faux? l’image MET est irréelle alors que l’image MEB est réelle

Answer 5

Faux, contraire

Question 6

Quel est le défi de la microscopie optique?

Answer 6

Choisir la meilleure approche pour une meilleure résolution

Question 7

Quel est le défi de la microscopie électronique?

Answer 7

Les échantillons doivent être préparés pour conserver leur structure (déshydrater et résister aux électrons)

Question 8

À quoi sert la déconvolution/traitement d’images?

Answer 8

Améliorer la résolution d’une image en choisissant les pixels qui sont nécessaires à l’images over ceux qui nuisent à la résolution

Question 9

Dans la microscopie confocale, qu’est-ce qui détermine en grande partie la résolution?

Answer 9

La taille de l’ouverture numérique

Question 10

Qu’est-ce que la super-résolution?

Answer 10

Combinant confocal avec traitement d’image semblable à la déconvolution -> jusqu’è 24 nm de résolution (pas réel)

Question 11

Que veut-on étudier si on choisi la MET?

Answer 11

L’ultrastructure

Question 12

En MET, on fixe les protéines avec quoi et les lipides avec quoi?

Answer 12

Glutaraldéhyde : fixer protéines
Osmium (bloque electrons): fixer lipides

Question 13

Après la fixation, quelles sont les étapes de préparation en MET?

Answer 13

Déshydrater, inclure dans bloc de résine, couper 1 um, choisir région d’intérêt et retailler plus petit, déposer sur grille

Question 14

Donne un exemple d’application de MET.

Answer 14

Absorption des lipides dans l’intestin, différentiation morphologique

Question 14

Pour identifier des vacuoles autophagiques dans cellules HIEC par nanoparticules en MET, comment fait-on?

Answer 14

Incuber les cellules intestinales avec particules d’or, incuber avec gluten et incuber avec or ET gluten = bloque le système autophagique

Question 15

Qu’est-ce que la coloration négative et ombrage en MET?

Answer 15

Entourer l’échantillon d’une fine couche de métal lourd. Les régions où l’échantillon n’est pas présent apparaissent alors plus sombres, tandis que les régions où l’échantillon est présent apparaissent plus claires, produisant ainsi une image inverse de l’échantillon. (modèle 3D des ribosomes)

Question 16

Qu’est-ce que la fixation douce et résines d’enrobage et à quoi elles servent?

Answer 16

Elles servent à préserver l’antigénécité pour immunocolocalisation.
Fixation: paraformaldehyde
résine: lowicryl qui tolère 5% d’Eau donc pas trop déshydraté. On peut déplastifier avec peroxyde pour immunolocaliser les antigènes.

Question 17

Quel est l’avantage de EM vs optique?

Answer 17

EM permet de distinguer où la structure est localisée, ce qui permet de comprendre son importance. Exemple: fibrinogen = à l’extérieur de la membrane basilaire (fibroréticularis), donc plus important dans attachement de la membrane basale au stroma que dans l’attachement de la cellule épithéliale à la membrane basale

Question 18

Quel est l’avantage et le désavantage de la Freeze substitution?

Answer 18

Évite les artéfacts de fixation et de déshydratation
MAIS limité dans son efficacité de congélation (-170 dege), si pas assez rapide = cristaux

Question 19

Qu’est-ce que la cryofracture?

Answer 19

Fixation de petits échantillons, l’imprégnation avec cryoprotecftant (glycérol) et la congélation rapide (-170deg). Ensuite fraturation et génération d’un réplicat par vaporisation de métaux
Permet d’aller séparer les feuillets membranaires
Elle consiste à refroidir rapidement un échantillon, souvent en le plongeant dans de l’azote liquide, puis à le casser ou le fracturer brusquement à basse température.

Question 20

Quelle est l’application de la cryofracture?

Answer 20

Aller voir les composantes cellulaires (tight junctions) et déterminer le but fonctionnel de structures comme les pores nucléaires

Question 21

Vrai ou faux: En MEB on utilise les mêmes techniques de préparation de l’échantillon que pour MET?

Answer 21

Faux, mais presque:
- fixe protéines et lipides (aldehyde et osmium)
- déshydrate et sèche et montage support
- vaporisation avec matériel conducteur (or)

Question 22

Que va permettre l’utilisation de l’or?

Answer 22

bon conducteur mais permet une bonne repulsion des electron et donc image de haute qualité

Question 23

Quel est l’avantage de MEB?

Answer 23

Très haute résolutions d’échantillons PLUS grands (1 mm)
Augmente le grossissement, mais résolution reste la même

Question 24

Vrai ou faux? MEB = bpc plus complet et représentatif que ME à transmission (MET) MAIS à prendre avec grain de sel, pcq image non réelle

Answer 24

Vrai

Question 25

Qu’est-ce que la technique Backscattered?

Answer 25

Les grains d’or sont blancs, ce qui permet de voir si la cellule a une belle bordure en brosse et pas beaucoup de particules d’or
Dans cette technique, un faisceau d’électrons est dirigé vers l’échantillon. Lorsque ces électrons interagissent avec les atomes de l’échantillon, certains d’entre eux sont rétrodiffusés (backscattered) vers le détecteur. La quantité d’électrons rétrodiffusés dépend de la composition chimique de l’échantillon : les éléments plus lourds et plus denses produisent généralement plus de rétrodiffusion que les éléments plus légers.

Question 26

Pour quelle applications utilisons nous la Cryo-EM?

Answer 26

Pour générer des structures 3D (beaucoup d’acquisition d’image)
-> les micro-éléments, complexe protéiques, ribosomes etc

Question 27

Comment utilisons nous la cryo-EM?

Answer 27

• Échant purifiés, déposés sur grille, système de congelation rapide dans solution acqueuse
  pH = concentration saline
• Si enlève les sels = prot se dénature, examine structures dans conditions natives, non dénaturés
• Congeler dans éthane (-160)
• Analyse dans mciroscope electronique congelé (-185)
• Structures à faible contrast
• Acqusitin : 1 million!!!
• À partir de ces acquisitions, on genere un modele mathematique pour avoir la structure 3D