Introduction à la microscopie Flashcards
Décris le principe de la microscopie électronique
Lentilles de verre sont des électro-aimants qui dirigent les électrons à travers l’échantillon le long d’une colonne qui est maintenue sous-vide et les électrons sont ralentis ou bloqués aux endroits les plus denses.
Décris le principe de la microscopie à épifluorescence
Source lumineuse émet différentes longueurs d’onde et la fibre d’excitation excite l’échantillon en étant réfracté par un miroir dichroique, qui a été préalablement incubé avec une molécule fluorescente qui réagit avec l’excitation spécifique
Décris le principe de MET
Faisceaux d’électrons contrôlés par une lentille électronique. L’écran est sensible à la lumière et si l’électron passe c’est noir et si l’électron ne passe pas, c’est blanc (noir et blanc)
Décris le principe de MEB
Quand l’électron frappe l’échantillon, il est recouvert d’un métal qui conduit l’électricité, et les électrons qui rebondissent sont captés par un capteur et analysés électroniquement. Donc l’image est reconstruite par la synthèse des électrons qui ont rebondi sur l’échantillon (pas une image réelle)
Vrai ou faux? l’image MET est irréelle alors que l’image MEB est réelle
Faux, contraire
Quel est le défi de la microscopie optique?
Choisir la meilleure approche pour une meilleure résolution
Quel est le défi de la microscopie électronique?
Les échantillons doivent être préparés pour conserver leur structure (déshydrater et résister aux électrons)
À quoi sert la déconvolution/traitement d’images?
Améliorer la résolution d’une image en choisissant les pixels qui sont nécessaires à l’images over ceux qui nuisent à la résolution
Dans la microscopie confocale, qu’est-ce qui détermine en grande partie la résolution?
La taille de l’ouverture numérique
Qu’est-ce que la super-résolution?
Combinant confocal avec traitement d’image semblable à la déconvolution -> jusqu’è 24 nm de résolution (pas réel)
Que veut-on étudier si on choisi la MET?
L’ultrastructure
En MET, on fixe les protéines avec quoi et les lipides avec quoi?
Glutaraldéhyde : fixer protéines
Osmium (bloque electrons): fixer lipides
Après la fixation, quelles sont les étapes de préparation en MET?
Déshydrater, inclure dans bloc de résine, couper 1 um, choisir région d’intérêt et retailler plus petit, déposer sur grille
Donne un exemple d’application de MET.
Absorption des lipides dans l’intestin, différentiation morphologique
Pour identifier des vacuoles autophagiques dans cellules HIEC par nanoparticules en MET, comment fait-on?
Incuber les cellules intestinales avec particules d’or, incuber avec gluten et incuber avec or ET gluten = bloque le système autophagique
Qu’est-ce que la coloration négative et ombrage en MET?
Entourer l’échantillon d’une fine couche de métal lourd. Les régions où l’échantillon n’est pas présent apparaissent alors plus sombres, tandis que les régions où l’échantillon est présent apparaissent plus claires, produisant ainsi une image inverse de l’échantillon. (modèle 3D des ribosomes)
Qu’est-ce que la fixation douce et résines d’enrobage et à quoi elles servent?
Elles servent à préserver l’antigénécité pour immunocolocalisation.
Fixation: paraformaldehyde
résine: lowicryl qui tolère 5% d’Eau donc pas trop déshydraté. On peut déplastifier avec peroxyde pour immunolocaliser les antigènes.
Quel est l’avantage de EM vs optique?
EM permet de distinguer où la structure est localisée, ce qui permet de comprendre son importance. Exemple: fibrinogen = à l’extérieur de la membrane basilaire (fibroréticularis), donc plus important dans attachement de la membrane basale au stroma que dans l’attachement de la cellule épithéliale à la membrane basale
Quel est l’avantage et le désavantage de la Freeze substitution?
Évite les artéfacts de fixation et de déshydratation
MAIS limité dans son efficacité de congélation (-170 dege), si pas assez rapide = cristaux
Qu’est-ce que la cryofracture?
Fixation de petits échantillons, l’imprégnation avec cryoprotecftant (glycérol) et la congélation rapide (-170deg). Ensuite fraturation et génération d’un réplicat par vaporisation de métaux
Permet d’aller séparer les feuillets membranaires
Elle consiste à refroidir rapidement un échantillon, souvent en le plongeant dans de l’azote liquide, puis à le casser ou le fracturer brusquement à basse température.
Quelle est l’application de la cryofracture?
Aller voir les composantes cellulaires (tight junctions) et déterminer le but fonctionnel de structures comme les pores nucléaires
Vrai ou faux: En MEB on utilise les mêmes techniques de préparation de l’échantillon que pour MET?
Faux, mais presque:
- fixe protéines et lipides (aldehyde et osmium)
- déshydrate et sèche et montage support
- vaporisation avec matériel conducteur (or)
Que va permettre l’utilisation de l’or?
bon conducteur mais permet une bonne repulsion des electron et donc image de haute qualité
Quel est l’avantage de MEB?
Très haute résolutions d’échantillons PLUS grands (1 mm)
Augmente le grossissement, mais résolution reste la même
Vrai ou faux? MEB = bpc plus complet et représentatif que ME à transmission (MET) MAIS à prendre avec grain de sel, pcq image non réelle
Vrai
Qu’est-ce que la technique Backscattered?
Les grains d’or sont blancs, ce qui permet de voir si la cellule a une belle bordure en brosse et pas beaucoup de particules d’or
Dans cette technique, un faisceau d’électrons est dirigé vers l’échantillon. Lorsque ces électrons interagissent avec les atomes de l’échantillon, certains d’entre eux sont rétrodiffusés (backscattered) vers le détecteur. La quantité d’électrons rétrodiffusés dépend de la composition chimique de l’échantillon : les éléments plus lourds et plus denses produisent généralement plus de rétrodiffusion que les éléments plus légers.
Pour quelle applications utilisons nous la Cryo-EM?
Pour générer des structures 3D (beaucoup d’acquisition d’image)
-> les micro-éléments, complexe protéiques, ribosomes etc
Comment utilisons nous la cryo-EM?
- Échant purifiés, déposés sur grille, système de congelation rapide dans solution acqueuse
pH = concentration saline - Si enlève les sels = prot se dénature, examine structures dans conditions natives, non dénaturés
- Congeler dans éthane (-160)
- Analyse dans mciroscope electronique congelé (-185)
- Structures à faible contrast
- Acqusitin : 1 million!!!
- À partir de ces acquisitions, on genere un modele mathematique pour avoir la structure 3D
