intro - diagnostic moléculaire Flashcards
diagnostic moléculaire - définition
Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigenome
Propriétés de l’ADN
- Acide nucléique = sucre+phosphate+base
- Charge négative (phosphate)
- ce qui lie acides nucléiques => Liens hydrogène:
- G-C : 3 * A-T :2
plus une région est riche en G-C plus on nécessitera une température …
plus une région est riche en G-C plus on nécessitera une température élevée pour la dénaturation
Variabilité non-pathologique vs pathologique:
Variabilité non-pathologique:
* Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de
référence n’étant pas associée à une pathologie génétique
Variabilité pathologique (Mutation):
* Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
Chaque individu porte plusieurs variations dans son génome - fréquence:
- ~5-6M lorsqu’on compare le génome d’un individu au génome de référence
- ~70 surviennent de novo, i.e. sont absentes chez les parents
pourquoi la plupart de ces variations n’ont pas d’impact phénotypique:
- Elles surviennent dans des régions non-codantes (régions intergéniques, introns) sans affecter l’expression du gène
- Elles sont des polymorphismes fréquents
- Elles touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
Causes des variations génétiques
endroits dans le génome où mutations sont plus suceptibles de subvenir:
Îlots CpG
Les dinucléotides CG sont des endroits de prédilection pour les mutations 1. C →methyl-C
2. Methyl-C →U
3. U→T
⦁CG → TG 20X plus fréquent que les autres mutations
Variabilité non-pathologique du génome
Types de variations selon taille
Grandes: CNV, LINE
Moyenne: **microsatellites **
Petites: SNP, indels
Microsatellites = ?
séquence répétée dans une partie du génome
- pour lequel différentes personnes ont un différent nombre de répétitions
=> répétitions d’une petite séquence
+ combinaison de plusieurs allèles possibles
SNP = ?
(single nucleotide polymorphism)
très fréquentes - surviennent à tous les 100 à 1000 pb
Variabilité pathologique du génome
Classification des variations génétiques
Fréquence des mutations par type
Différentes conséquences des variations
- Homologue (silencieux): change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé
–> donc protéine finale demeure inchangée (pareille) + exception - quand elles surviennent à un endroit où il y a épissage (peuvent devenir pathologique mais rarement) - Faux-sens (missense): change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
- Non-sens (nonsense): change le codon pour un codon stop –donne une protéine tronquée => variation pathogénique
- Altération du cadre de lecture (frameshift): insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une modification du codon et de ceux en aval –> tous les aa sont changées => protéines changée et courtée
Perte et gain de fonction
Perte de fonction: une réduction dans la quantité de la protéine produite, ou une réduction de l’activité de la protéine, entraîne le phénotype
=>Base de la majorité des conditions récessive. Fréqentes, base de l’Haploinsuffisance(une mutation donminante diminue transciption de la protiéine ou fonction)
perte de fonction comme mécamnisme causale de maladie dominante
Gain de fonction: une augmentation dans la quantité de la protéine produite, une augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraîne le phénotype => plus rare
Mécanismes associés aux gains de fonction
A. Augmentation du dosage génique (nbre de copies d’un gène différent du nbre de 2 copies attendues)
B. Altération de l’expression de l’ARNm
C. Activité accrue de la protéine
D. Nouvelle fonction de la protéine
E. Altérations toxiques à la protéine
Mutations dynamiques = ?
séquence répétée avec une variation dans le nbre dans la population
- cependant y’a un seuil qui lorsque dépassé => associée à des maladies importantes
Isolation de l’ADN
–> où trouve-t-on l’ADN (type de cellules)
–> but:
présentes dans Cellules nucléées (sang: leucocytes)
But: isoler du reste du contenu cellulaire (majoritairement protéines)
Il faut se servir des caractéristiques spécifiques de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire
Isolation de l’ADN
Évaluation de l’efficacité de l’isolation de l’ADN
avec spectrophotométrie
Densité optique
* λ 260nm = absorbance max ADN (280mm pour protéines)
* Estimation de la quantité de l’ADN (ratio 260/280 estime pureté)
Teintures intercalantes (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
* Composés qui se fixent à l’ADN double brin
* Estimation de la quantité et de la taille de l’ADN
Techniques de base
Hybridation = ?
On construit une séquence de nucléotides complémentaire à une portion de l’ADN du patient (sonde)
Elle est marquée (fluorescence, radioactivité);
La détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
=> 2 sondes
- une complémentaire à la séquence normale (allèle normal)
- une autre sonde complémentaire à l’allèle muté
Buvardage Southern: étapes + permet de faire quoi?
A. Digestion de l’ADN génomique => digéré avec enzymes de restriction pour avoir des fragments d’une taille donnée
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane (migration du gel vers le papier)
D. Hybridation (hybridation sur le papier)
E. Détection par autoradiographie
But: Permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
quelle est la polymérase la plus utilisée pour PCR?
Taq
Délétion récurrente 8pb LRPPRC exon 35
Contamination foeto-maternelle
PCR-digestion: Applications
Mutations ponctuelles récurrentes:
Il est habituellement possible de trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
Allele Specific Primer Extension
Amplification PCR
Jeu d’amorces marquées fluorescence dont certaines ont mismatch 3’
Extension ssi match 3’
Détection
Séquençage Sanger - ddNTPs (nucléotides modifiées)
Contrairement aux dNTPs, les ddNTPs n’ont pas de -OH au C3 du ribose. Ceci empêche la liaison du prochain dNTP (chain termination)
L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est aléatoire
PCR temps-réel + applications:
Réaction de PCR avec détection du produit simultanée
Possibilités:
* Discrimination allélique => pour voir si mutation connue au préalable est présente ou pas
* Quantification (relative/absolue) => délétion ou duplication d’un gènes
PCR temps réel pour discrimination allélique
Discrimination allélique
* amorce marquée
* sonde marquée
Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations
PCR temps réel quantitative:
On fixe un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence (RFU))
Ce seuil est le même pour tous les patients testés
Comme dans la PCR la quantité d’ADN double à chaque cycle
=>
peut être utilisé pour comparer des patients ensemble => inférer le nbre de copies d’ADN
- nbre de cycle fait selon une référence peut soit indiquer une délétion ou duplication
Scénario:
Échantillon 1, seuil atteint après 24 cycles (n)
Échantillon 2, seuil atteint après 25 cycles (n+1)
—
Puisque le nombre de molécules d’ADN double à
chaque cycle, et que le seuil est le même pour les deux échantillons, il y avait 2X moins d’ADN dans l’échantillon 2 au départ
MLPA: Multiplex Ligation Probe Amplification = ?
Méthode pour la recherche de délétions/duplications
Sonde en deux sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient
Ligase scelle ensuite les 2 sous-unités Amplification PCR
Électrophorèse capillaire
=> gènes avec bcp d’exons qu’ont veut tous testés
2 façons de faire amplification en parallèle (microcompartiments)
explications de la séquence parallèle :
Application 2: ADN foetal circulant
Milieu des années 1990: ADN foetal circulant et ADN tumoral circulant Produit par l’unité placentaire
Courte taille
Courte T1⁄2
Variation absente chez la mère: facile (Y, RhD)
