immunoassay e binding assays Flashcards
cosa sono in generale i immunoassay e binding assays
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differenza tra anticorpi monoclonali e policlonali
cosa sono gli anticorpi?
ricordati che sono glicoproteine
che forma hanno gli anticorpi ?
spiega la struttura degli anticorpi disegnando la loro struttura e indicando dove si trovano e a che servono le seguenti parti:
dominio costante, dominio variabile, catene pesanti catene leggere, hinge regione, fab region. fc region. spiega qual è la regione che lega l’ antigene
catene pes e leggere sono tenute assieme tramite ponti disolfuro
fc sta per fragment cristallizable portion. essa lega i recettori di stuperficie delle cellule del sistema immunitario
quanto sono grandi le catene pesanti e leggere ? (Da)
50.0000 Da e 25.000 Da
cosa è l’epitopo e il paratopo?
come vengono prodotti anticorpi monoclonali e policlonali?
gli anticorpi policlonali vengono estratti dal siero
gli anticorpi monolonali vengono prodotti con la fusione tra cellule beta e mieloma
parla di costi e tempi nella produzione di policlonali, parla dell’affinità per l’antigene e specificità
policlonali economici, tre mesi di tempo. elevata affinità e sensibilità
differenza tra ingegnerizzazione di mono e policlonali
i poli sono meno suscettibili. pag 56
policlonali. cosa è la bach to bach variability e la cross reactivity
bach to bach variability dipende dall’animale e dal momento in cui viene iniettato l antigene
monoclonali. parla delle differenze rispetto ai policlonali rispetto a riproducibilità e tempi cross reactivity e sensibilità suscettibilità a modifiche chimiche costi tempi ?
si osserva un’elevata riproducibilità.
elevata specificità
bassa cross reactivity
minor sensibilità
più suscettibili rispetto a modifiche chimiche
maggiori costi
maggiori tempi, 6 mesi
recombinant antibodies. spiega la tecnica di produzione e parla dei costi tempi modifiche funzionali e strutturali dell’anticorpo, vantaggi etici
gli anticorpi usati nell’immuno assay di che tipo sono?
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interazione anticorpo antigene dal punto di vista chimico
scrivi la costante di (affinità) e dissociazione anticorpo antigene
cosa è l’avidità di un un anticorpo?
misura totale dei binding sites sull’anticorpo. quindi è la misura della forza di binding totale dell’anticorpo.
cosa è la multivalency di un anticorpo?
presenza di più binding sites sulla stessa proteina
differenza tra igG e igM per quanto riguarda affinità e avidità.
disegna il modo in cui l’arrangiamento strutturale di un antigene aumenta l’avidità.
igG: anticorpi con minor numero di binding sites. maggiore affinità ma minor avidità
igM: anticorpi con maggior numero di bs. minore affinità e maggiore avidità
Affinità è la forza di legame di un singolo sito di legame per un epitope specifico.
Avidità è la forza complessiva di legame che un anticorpo esercita su un antigene, tenendo conto di tutti i suoi siti di legame.
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scrivi l’equazione di equilibrio anticorpo antigene. scrivi la kd. scrivi la frazione di saturazione e spiega cosa sia. ricava P dall equazione della kd, sostituiscila in quella della frazione di saturazione. da cosa dipende la frazione di saturazione? cosa è la kd? ad alte concentrazioni di ligando cosa succede?
guarda nota
da che funzione è definita la curva di binding? che condizioni sono richieste? disegnala mettendo sulle y il segnale e sull’e x target su kd. che forma ha? mostra il detection range e spiega cosa è
La curva di binding viene definita in termini di isoterma di Langmuir; → variazione della
concentrazione del complesso presente al variare ella concentrazione del target.
Sono però richieste delle condizioni per cui tale funzione possa descrivere il processo: -
Un componente in eccesso all’altro. → in questo caso il target. - - -
Single site binding. → tale curva descrive un singolo sito di binding.
Singola Kd.
Non ci siano reazioni di off-target
che succede con una kd troppo alta? e troppo bassa?
Cos’è un “buon” KD?
Alcuni fraintendimenti legati al riconoscimento molecolare derivano dai nostri pregiudizi impliciti. Uno di questi pregiudizi è il concetto di un KD oggettivamente “migliore”; siamo inclini a pensare che un KD più basso sia intrinsecamente superiore, perché lavoriamo principalmente in condizioni in cui il KD è più alto rispetto alla concentrazione dell’oggetto che stiamo cercando di rilevare. In pratica, il concetto di un “migliore” KD è rilevante solo nel contesto di un intervallo di rilevamento desiderato. Spesso trascuriamo il fatto che quantificare le concentrazioni di albumina nell’intervallo di 1 mM utilizzando un reagente di affinità con KD = 1 μM è altrettanto difficile quanto quantificare le concentrazioni di insulina nell’intervallo di 1 nM usando un reagente con la stessa affinità (Figura sotto). Se il KD è troppo alto, il segnale sull’intervallo di rilevamento desiderato sarà troppo debole; se il KD è troppo basso, il segnale risultante sarà già saturo e non cambierà nell’intervallo di rilevamento desiderato. In entrambi i casi, la capacità di distinguere cambiamenti nella concentrazione del target tramite spostamenti nell’equilibrio viene persa. In ultima analisi, è importante abbinare l’intervallo di rilevamento allo scenario clinico in questione. Pertanto, un buon KD efficace o un intervallo di rilevamento può essere definito solo in termini di un dato contesto biologico. Ad esempio, un reagente di affinità con un KD di 1 μM è perfetto per rilevare ATP nel sangue, poiché il suo livello basale è dell’ordine di 20 nM a 1 μM. Al contrario, un reagente di affinità con KD = 1 pM verso l’ATP sarebbe praticamente inutile, perché qualsiasi deviazione ragionevole nella concentrazione di ATP non comporterebbe un cambiamento osservabile nel legame.
test elisa. a che serve? come si svolge questo saggio ? fai la differenza tra direct elisa e indirect elisa
si ha un substrato (plate) sul quale viene
l’enzima coniugato è di solito fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano
vantaggi del direct elisa per quanto riguarda i tempi e cross reactivity e svantaggi per quanto riguarda affinità dell’anticorpo per l’antigene e scelta dell’anticorpo primario
