immunoassay e binding assays Flashcards
cosa sono in generale i immunoassay e binding assays
PAG 58
differenza tra anticorpi monoclonali e policlonali
cosa sono gli anticorpi?
ricordati che sono glicoproteine
che forma hanno gli anticorpi ?
spiega la struttura degli anticorpi disegnando la loro struttura e indicando dove si trovano e a che servono le seguenti parti:
dominio costante, dominio variabile, catene pesanti catene leggere, hinge regione, fab region. fc region. spiega qual è la regione che lega l’ antigene
catene pes e leggere sono tenute assieme tramite ponti disolfuro
fc sta per fragment cristallizable portion. essa lega i recettori di stuperficie delle cellule del sistema immunitario
quanto sono grandi le catene pesanti e leggere ? (Da)
50.0000 Da e 25.000 Da
cosa è l’epitopo e il paratopo?
come vengono prodotti anticorpi monoclonali e policlonali?
gli anticorpi policlonali vengono estratti dal siero
gli anticorpi monolonali vengono prodotti con la fusione tra cellule beta e mieloma
parla di costi e tempi nella produzione di policlonali, parla dell’affinità per l’antigene e specificità
policlonali economici, tre mesi di tempo. elevata affinità e sensibilità
differenza tra ingegnerizzazione di mono e policlonali
i poli sono meno suscettibili. pag 56
policlonali. cosa è la bach to bach variability e la cross reactivity
bach to bach variability dipende dall’animale e dal momento in cui viene iniettato l antigene
monoclonali. parla delle differenze rispetto ai policlonali rispetto a riproducibilità e tempi cross reactivity e sensibilità suscettibilità a modifiche chimiche costi tempi ?
si osserva un’elevata riproducibilità.
elevata specificità
bassa cross reactivity
minor sensibilità
più suscettibili rispetto a modifiche chimiche
maggiori costi
maggiori tempi, 6 mesi
recombinant antibodies. spiega la tecnica di produzione e parla dei costi tempi modifiche funzionali e strutturali dell’anticorpo, vantaggi etici
gli anticorpi usati nell’immuno assay di che tipo sono?
pag 57
interazione anticorpo antigene dal punto di vista chimico
scrivi la costante di (affinità) e dissociazione anticorpo antigene
cosa è l’avidità di un un anticorpo?
misura totale dei binding sites sull’anticorpo. quindi è la misura della forza di binding totale dell’anticorpo.
cosa è la multivalency di un anticorpo?
presenza di più binding sites sulla stessa proteina
differenza tra igG e igM per quanto riguarda affinità e avidità.
disegna il modo in cui l’arrangiamento strutturale di un antigene aumenta l’avidità.
igG: anticorpi con minor numero di binding sites. maggiore affinità ma minor avidità
igM: anticorpi con maggior numero di bs. minore affinità e maggiore avidità
Affinità è la forza di legame di un singolo sito di legame per un epitope specifico.
Avidità è la forza complessiva di legame che un anticorpo esercita su un antigene, tenendo conto di tutti i suoi siti di legame.
pag 58
scrivi l’equazione di equilibrio anticorpo antigene. scrivi la kd. scrivi la frazione di saturazione e spiega cosa sia. ricava P dall equazione della kd, sostituiscila in quella della frazione di saturazione. da cosa dipende la frazione di saturazione? cosa è la kd? ad alte concentrazioni di ligando cosa succede?
guarda nota
da che funzione è definita la curva di binding? che condizioni sono richieste? disegnala mettendo sulle y il segnale e sull’e x target su kd. che forma ha? mostra il detection range e spiega cosa è
La curva di binding viene definita in termini di isoterma di Langmuir; → variazione della
concentrazione del complesso presente al variare ella concentrazione del target.
Sono però richieste delle condizioni per cui tale funzione possa descrivere il processo: -
Un componente in eccesso all’altro. → in questo caso il target. - - -
Single site binding. → tale curva descrive un singolo sito di binding.
Singola Kd.
Non ci siano reazioni di off-target
che succede con una kd troppo alta? e troppo bassa?
Cos’è un “buon” KD?
Alcuni fraintendimenti legati al riconoscimento molecolare derivano dai nostri pregiudizi impliciti. Uno di questi pregiudizi è il concetto di un KD oggettivamente “migliore”; siamo inclini a pensare che un KD più basso sia intrinsecamente superiore, perché lavoriamo principalmente in condizioni in cui il KD è più alto rispetto alla concentrazione dell’oggetto che stiamo cercando di rilevare. In pratica, il concetto di un “migliore” KD è rilevante solo nel contesto di un intervallo di rilevamento desiderato. Spesso trascuriamo il fatto che quantificare le concentrazioni di albumina nell’intervallo di 1 mM utilizzando un reagente di affinità con KD = 1 μM è altrettanto difficile quanto quantificare le concentrazioni di insulina nell’intervallo di 1 nM usando un reagente con la stessa affinità (Figura sotto). Se il KD è troppo alto, il segnale sull’intervallo di rilevamento desiderato sarà troppo debole; se il KD è troppo basso, il segnale risultante sarà già saturo e non cambierà nell’intervallo di rilevamento desiderato. In entrambi i casi, la capacità di distinguere cambiamenti nella concentrazione del target tramite spostamenti nell’equilibrio viene persa. In ultima analisi, è importante abbinare l’intervallo di rilevamento allo scenario clinico in questione. Pertanto, un buon KD efficace o un intervallo di rilevamento può essere definito solo in termini di un dato contesto biologico. Ad esempio, un reagente di affinità con un KD di 1 μM è perfetto per rilevare ATP nel sangue, poiché il suo livello basale è dell’ordine di 20 nM a 1 μM. Al contrario, un reagente di affinità con KD = 1 pM verso l’ATP sarebbe praticamente inutile, perché qualsiasi deviazione ragionevole nella concentrazione di ATP non comporterebbe un cambiamento osservabile nel legame.
test elisa. a che serve? come si svolge questo saggio ? fai la differenza tra direct elisa e indirect elisa
si ha un substrato (plate) sul quale viene
l’enzima coniugato è di solito fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano
vantaggi del direct elisa per quanto riguarda i tempi e cross reactivity e svantaggi per quanto riguarda affinità dell’anticorpo per l’antigene e scelta dell’anticorpo primario
vantaggi del indirect elisa per la scelta dell’anticorpo, affinità dell’anticorpo per l’antigene, sensibilità del metodo. svantaggi per quanto riguarda la cross reactivity, tempi. specificità
la sensibilità è più alta rispetto a un elisa diretto. gli anticorpi secondari sono anticorpi policlonali quindi riconoscono più epitopi. più anticorpi sec si possono legare all’anticorpo primario, portando quindi alla formazione di una maggiore quantità di segnale.
sandwich elisa. spiega come viene eseguito e come può avvenire la rilevazione ? cosa vuol dire non overlapping part?
vantaggi del sandwich elisa dal punto di vista di specificità. svantaggi dal punto di vista di tempi e costi
competitive elisa. spiega il concetto di signal off. fai un esempio di allestimento di competitive elisa : uno con plate funzionalizzato con anticorpo e uno con antigene
vantaggi del competitive elisa. che tipi di campioni si possono analizzare? perchè si ha uno standard interno?
Quando si analizzano campioni non trattati, l’effetto della matrice (ovvero degli altri componenti presenti nel campione) viene “compensato” dalla competizione tra il campione di antigene e l’antigene etichettato. Poiché entrambi competono per lo stesso sito di legame, la matrice avrà effetti simili sia sull’antigene target che su quello reporter (marcato), riducendo l’impatto delle interferenze non specifiche. Questo agisce come una sorta di “standard interno”, migliorando l’affidabilità del test anche senza purificare completamente il campione.
vantaggi del competitive elisa. parla di specificità rispetto a sandwich elisa e complessità del protocollo
fluorescent immunoassay. cosa cambia rispetto all’ elisa?
immunohistochemistry cosa è ?
fai un esempio di lateral flow immunoassay molto comune
test covid
spiega come quali sono le componenti di un lateral flow immunoassay e qual è il funzionamento del test.
quali sono i vantaggi e gli svantaggi dell’utilizzo di un test covid da farmacia?
cosa è il sample pad ? conjugate release pad? detection zone? controllo?
