amplificazione degli acidi nucleici Flashcards
che differenza c’è tra amplificazioni enzimatiche e non enzimatiche ?
PCR. qual è l’obiettivo di questa tecnica ? cosa serve per allestire questa tecnica (regenti, enzimi)? nome dell’enzima usato di solito e da dove deriva. qual è il prodotto finale ? descrivi la tecnica dal punto di vista delle temperature da usare. calcola quanti duplex sono presenti in soluzione alla fine
pcr. come devono essere i primer da usare? lunghezza, composizione in basi, differenza di tm tra i due primer , tm del singolo primer, teamperatura di annealing rispetto alla tm.
cosa si intende per primer forward e reverse
Fondamentale è l’utilizzo dei primers e quindi il loro “disegno”: -
Generalmente lunghezze tra le 18-24 basi. - - - -
Contenuto in G/C del 40-60%. → tale contenuto determina la stabilità del duplex che si
forma tra primer e sequenza target.
Possibilmente l’inizio e la fine del primer devono presentare 1-2 coppie G/C. → effetto pinza
nell’ibridazione.
I primers devono avere una Tm con una differenza fra i singoli primer non superiore ai 2-5°C.
I primers dovrebbero presentarsi nella loro solo forma a single strand e non andare a creare
particolari strutture secondarie, ripiegandosi su se stessi, che comporterebbero una minor
disponibilità del primer stesso per la reazione di PCR.
La temperatura di melting fra i 2 primer deve essere tra i 2 ed i 5°C; in assoluto la temperatura di
melting dei primer deve essere di 50-60°C. → è molto importante perché determina poi la
temperatura di lavoro, temperatura di annealing, nei cicli di temperatura. → la temperatura di
annealing non dovrebbe essere più di 5°C al di sotto della temperatura di melting dei primer;
a temperature di annealing troppo basse si favorisce altrimenti la formazione di duplex non specifici,
ovvero laddove non devono formarsi. → ovvero il primer, a temperature troppo basse, presenta una
minor specificità nei confronti della sequenza target con cui si anneala (può ibridizzare anche a
sequenze non perfettamente complementari). → riduzione della resa.
Al contrario, ovviamente, se la T di annealing è molto più alta della T di melting il primer non riesce
ad annealarsi alla sequenza target. → riduzione della resa.
I primer li troviamo indicati con forward primer (lega il filamento antisenso del duplex iniziale, che ha
direzione 3’-5’) e quello reverse (lega al filamento senso, che ha direzione 5’-3’).
Reverse trascrptase polymerase chain reaction.
-obiettivo
-reagenti ed enzimi. spiega a che servono
Real time quantity PCR.
-obbiettivo
- disegna il grafico di una qPCR e spiegalo (threshold, ct. fase esponenziale, plateau)
- come è possibile quantificare gli ampliconi? specifica a che serve il ct in questa fase.
spiega come si fa la dye-based qPCR. fai esempio di SYBR Green. svantaggi di questo metodo
uso di TaqMan probes per il monitoraggio della qPCR. cosa è una TaqMan probe e come è formata? spiega come avviene la reazione ?
perchè è più specifica rispetto all’utilizzo di SYBR Green?
come si può parallelizzare il processo e che vuol dire?
molecular beacons come probe per qPCR. cosa sono i molecular beacons e come sono fatti? come funziona questa tecnica ? cosa succede quando la dna pol incontra il molecular beacon?
cosa è una terapia antimir ? come si fa a capire se il trattamento riesce a bloccare/silenziare o meno il miRNA
metodo delta delta ct a che serve? descrivi i calcoli
-spiega come bisogna organizzare i campioni
-spiega che ct values bisogna avere
- costruisci la prima tabella in cui sono presenti controllo e trattato sia per il gene di interesse che per l’housekeeping e spiega che dati bisogna raccogliere
- poi cosa bisogna fare?
- come calcolare il calibrator e a cosa serve
- che valore numerico avrà il delta delta ct dei campioni di controllo e perchè
-come si calcola la fold gene expression ?
come ti aspetti che sia la fge per il controllo e per il trattato ?
loop mediated isotermal amplificaton (LAMP).
quali sono le differenze rispetto a una PCR classica?
spiega la tecnica: primers, enzimi utilizzati, cosa avviene, cosa si ottiene, per quali applicazioni è adatta.
Recombinase polymerase amplification (RPA). differenza rispetto alla pcr. perchè non è necessaria la fase di denaturazione e come come si chiama il processo di appaiamento dei primers e come avviene? è necessaria anche una proteina di binding, come si chiama e a che serve? come avviene l’allungamento? Qual è il prodotto finale ?
nucleic acid sequence based amplification NASBA. differenze rispetto a PCR. che materiale genetico si amplifica con questa tecnica? che reagenti servono ? spiega la reazione
transcription mediated amplification. differenze risoetto a NASBA
rolling circle amplification. qual era la tecnica originale e come e perchè è stata corretta? quali sono i reagenti ed enzimi e prodotti e come si svolge? cosa ci permette di fare?
