II. 4- Méthodes d’identification des mutations délétères à l’origine des maladies héréditaires mendéliennes monogéniques Flashcards
Techniques d’identification de mutation
- séquençage Sanger
- Etudes de liaison
- MLPA = Multiplex Ligation-dépendant Probe Amplification
- NGS
Séquençage Sanger
Mise au point dans les années 1970, cette technique est encore la technique de référence de nos jours.
La technique de Sanger utilise le principe de la synthèse enzymatique de l’ADN à séquençer en présence d’inhibiteur d’élongation de l4ADN polymérase : les ddNTTP (di-déoxynuécléotides)
1) amplifier l’ADN à séquencer au moyen d’une PCR (polymerase chain reactor).
2) l’ADN matrice est ensuite mis en présence d’une amorce spécifique de la région à séquencer ainsi que d’nu mélanger de dNTP et de ddNTP marqué par un fluorochrome (4 fluorochomes différents) dans un ration tels que statistiquement, il y a l’incorporation de ddNTP à chaque position.
3) Ainsi la réaction enzymatique vagénérer un mélange de fragments de différentes tailles ayant tous la même extrémité 5’ avec des résidus de ddNTP en 3’.
4) Les fragments sont ensuite séparés par une électrophorèse capillaire.
5) Après traitement informatique, les signaux de fluorescence sont présentés sous forme de chromatogramme qui permet une lecture directe de la séquence du brin d’ADN complémentaire du brin séquencé.
Etudes de liaison
Les études de liaison utilisent le polymorphisme de taille des séquences micro satellites (séquences répétées) autour d’une région chromosomique pour détecter des régions d’homozygotes.
La présence de ces régions autour d’un gène connu pour transmettre une maladie autosomique récessive suggère la présence d’une mutation homozygote sans pouvoir l’affirmer ou la caractériser. Il faut pour cela disposer d’ADN du cas index et de ses parents.
Cette technique peut être utile pour les gènes de grandes tailles (plusieurs dizaines d’exons difficiles à séquencer par la méthode de Sanger.
MLPA
Multiplex Ligation-Probe Amplification est une technique de PCR multiplex permettant la détection d’un nombre anormal de copies génétiques d’un ou plusieurs gènes (impossible à mettre en évidence par la séquençage de Sanger)
La technique repose sur l’hybridation d’une sonde divisée en 2 partie sur la séquence du gène d’intérêt .
Une fois hybridée, les 2 parties sont liguées puis amplifiées par une réaction de PCR.
Les amplios sont détectés via un marqueur fluorescent après une électrophorèse capillaire.
La comparaison de l’intensité dusignal par rapport à un contrôle possédant 2 copies du gène permet la mise en évidence de délétion hétérozygote (signal 0,5 de celui du témoin) ou de duplication (signal 1,5 de celui d témoin) sur tout ou une partie du gène.
Méthode rapide et peu couteuse ⚠
NGS : principe
Depuis 2004, de nouvelles techniques de séquençage haut débit ont fait leur apparition.
Ces techniques nécessitent la fragmentation de l’ADN matrice puis la ligation d’adaptateurs (qui sont complémentaires des amorces utilisées dans la suite de la réaction). L’amplification des banques d’ADN matrice se fait ensuite par des réactions de PCR.
La technique la plus utilisée est celle commercialisée par Illumina : la PCR par pontage (bridge amplification). Chaque exemplaire d’ADN de la banque à séquencer est représenté par un groupe de fragments clonaux appelé “cluster”. Les clusters sont attachés à la surface d’une lame de verre appelée “flot-cell”
Lors d’un cycle de synthèse, l’ADN polymérase, l’amorce d’initiation et les 4dNTP sont ajoutés. Chaque dNTP est marqué par un fluorochrome différent, ils sont tous modifiés avec une extrémité 3’OH bloquée de façon à inhiber l’élongation. La fluorescence du dNTP incorporé est mesurée avant qu’une réaction chimique n’enlève le fluorochrome et débloque l’extrémité 3’ afin de permettre l’élongation lors d’un nouveau cycle.
Les données générées nécessitent une analyse bio-informatique importante qui permet in fine d’aligner les séquences sur un génome de référence et les comparer afin de pointer les variations
Panel ciblé
Les panels ciblées permettent le séquençage concomitant d’une dizaine voire de plusieurs centaines de gènes grâce à des sondes de captures spécifiques des régions exotiques des gènes d’intérêt. Ces panels NGS sont actuellement utilisés en routine pour le diagnostic de maladies génétiques associées à des signes pouvant évoquer plusieurs causes génétiques (MAI, autisme, déficits immunitaires). Leur profondeur de couverture importante leur permet une détection aisée des CNV.
Le résultat es disponible relativement rapidement (1-2 mois) et l’interprétation relativement aisée (pas de “nouveaux gènes”). Cette stratégie nécessite une actualisation régulière en fonction des nouveaux gènes publiés.
WES
Le séquençage de l’exome entier utilise des sondes de capture qui couvrent toutes les régions exotiques du génome. Encore peu utilisé en routine diagnostique (plutôt en recherche), c’est néanmoins la technique qui sera probablement utilisée dans qq années.
Son prix est quasiment équivalent à celui des panels ciblé comportant de nombreux gènes. L’utilisation d’un filtre étudiant seulement les gènes décrits permet de simplifier l’analyse.
WGS
Le séquençage du génome entier génère bueacoup plus de données que les 2 premières approches. Il a l’avantage de ,eus générer de biais puisqu’il ‘y a pas d’étape de capture comme pour les panels ou le WES. Certains protocoles n’utilisent pas d’amplification par PCR limitant ainsi les erreurs inhérentes à cette technique. Il est pour l’instant réservé aux laboratoires de recherches.
Son prix est plus élevé que celui du WES et les difficultés d’interprétation sont plus importantes.
Ségrégation familiale
- peut permettre d’exclure un variant de signification indéterminée
→ pour une maladie de transmission autosomique récessive : si le patient présente deux variations hétérozygotes différentes, il faut déterminer si ces variations se trouvent sur le même allèle ou sur 2 allèles différents (hétérozygote composite). Pour cela, le séquençage du gène étudié chez les deux parents permet d’apprécier l’origine de ces variations.
→ pour une maladie de transmission autosomique dominante : il faut déterminer si la variation est apparue uniquement chez le cas index (mutation de novo) ou si elle a été transmise par un des parents. La présence de la variation chez l’un des parents ou d’autres membres de la famille (fratrie, oncle, tante, cousin) ne présentant pas symptômes de la maladie diminue la probabilité que ce variant soit causal. Néanmoins certaines maladies génétiques sont à pénétrante incomplète (probabilité de déclencher la maladie si allèle muté < 100%) ou peuvent se manifester tardivement.
Toute variation doit être interprétée par un généticien et un clinicien connaissant la maladie en question
Outils utilisés pour interpréter des données mutationnelles ?
- base de données
Les bases de données publiques de fréquence des variants dans la population générale sont très utiles pour l’interprétation. Au delà de 1% de fréquence allélique, on parle de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ou polymorphisme. La fréquence du variant à interpréter doit être cohérente avec la fréquence de la maladie dans la population. - scores de prédiction
Les scores de prédiction in silico permettent de prédire l’impact du variant sur la fonction de la protéine. Ils sont nombreux, l’association de plusieurs scores permet d’augmenter leur fiabilité.
Il existe également des scores permettant de prédire l’impact d’une variation su rl’épissage si celle-ci se trouve dans une région de jonction intron/exon.
test fonctionnels
Lorsqu’ils sont disponibles, ces test permettent d’affirmer avec un caractère presque certain l’impact de la mutation sur l protéine. Il peut s’agir dans un premier temps de l’étude de l’expression protéique : globale par western blot, à la surface ou intracellulaire par cytométrie en flux.
