Hibridoma y ADN Recombinante Flashcards
2 mitad
¿Cual de las siguientes enzimas bacterianas es responsable de restringir el crecimiento de virus?
- Topoisomerasa
- Girasa
- Proteasa
- Enzimas de restricción
Enzimas de restricción
¿Cual de las siguientes enzimas se utiliza para unir dos fragmentos de DNA?
- Proteasa
- Endonucleasa
- Ligasa
- Exonucleasa
Ligasa
El gen de resistencia antibioticos puede ser utilizado como marcador de ……….
-Diferenciacion de celulas transformadas
- Radioactividad de celulas transformadas
- Seleccion de celulas transformadas
- Similitud de celulas transformadas
Seleccion de celulas transformadas
Se le llama DNA recombinante cuando
Hay secuencias de DNA derivadas de mas de una fuente
Los anticuerpos monoclonales son producidos por:
Tecnologia de hibridoma
Los sitios que reconocen las enzimas de restriccion :
- Regiones ricas en AT
- Secuencias palindromicas
- Regiones ricas en CG
- Secuencias en tandem
Secuencias palindromicas
¿Que es lo que ayuda a identificar a las celulas transformadas?
Marcador de seleccion
El proceso por el cual un DNA foraneo es introducido a una bacteria, se llama:
transformación
Para insertar un gen en un plasmido, los dos:
- Deben de tener secuencia identica de DNA
- Deben ser del mismo tamaño
- Se originan de la misma celula
- Deben de ser cortados por la misma enzima de restriccion
Deben de ser cortados por la misma enzima de restriccion
Sufijo de un anticuerpo monoclonal humano:
mumab
Para que mi plasmido funcione como vector debe tener en su estructura
Debe tener un origen de replicación, gen de resistencia antibiótica y región de ADN exógeno (20kb).
En el DNA recombinante:
- Esta formado por dos fragmentos de DNA de la misma especie.
- Determinados fagos y plásmidos son utilizados como vectores
- EL DNA recombinante no se puede introducir en el citoplasma
- El DNA del vector puede ser cualquier molécula de DNA
Determinados fagos y plásmidos son utilizados como vectores
El DNA recombinante se crea a partir de:
- Protozoarios
- Bacterias
- Parásitos
- Virus
Bacterias
Enzimas de restricción corta en el mismo sitio de reconocimiento y son utilizadas en tecnología del DNA recombinante
Tipo II
Cual es proceso general de formar un ADN recombinante? (5)
- Se selecciona un gen de una célula eucariota y se corta con una enzima de restricción
- Se agarra un plásmido de una bacteria y se corta con la misma enzima de restricción.
- Se inserta el gen de la eucariota, con la ayuda de un bacteriofagio, en el plásmido y se unen con una ligasa.
- Se introduce el ADN recombinado en la célula huésped.
- La células hueésped (bacteria) clona el gen y produce sus productos.
La nomenclatura de bacterias se puede dividir en 3 partes. Cuales son estas partes?
- Acrónimo de 3 letras cursivas: 1 es género, 2 y 3 nombre de la especie.
- Letras y/o número de acuerdo a la cepa o serotipo.
- Número romanos de acuerdo a la cronología en que se aislaron (descubrieron).
Que son las enzimas de restricción?
Son las enzimas que cortan el ADN extraño. Actuan como mecanismo de defensa de las bacterias.
Las enzimas de restricción se pueden dividir en dos tipos. Cuales son estos?
- Enzimas del sistema de modificación: principalmente metilasas que metilan los residuos de adenina o citosina del ADN propio para evitar su degradación.
- Endonucleasas: cortan.
Cual es el tipo 1 de endonucleasa?
Son asimétricos y cortan el ADN muy lejos (1000pb) del sitio de reconocimiento. –> Sitio de corte aleatorio. Puede ser rio abajo o rio arriba.
Cual es el tipo 2 de endonucleasa?
Reconocen secuencias palindrómicas las cuales van a ser el sitio de reconocimiento y el sitio de corte. Hacen dos tipos de corte.
Cual es el tipo 4 de endonucleasa?
Reconoce el ADN metilado. Importantes en el sistema de defensa.
Que son los vectores?
Son estructuras capas de albergar un fragmento de ADN exógeno.
Cual es la endonucleasa más usada en la tecnología de ADN recombinante? Por qué?
La endonucleasa tipo 2 debido a su corte predecible
Cuales son los dos tipos de corte de las endonucleasas tipo 2?
- Cohesivo: cortes asimétricos, dejando extremos cohesivos/complementarios. 3-5nt de diferencia.
- Romo: cortes simétricos en ambas cadenas.
Cual es el tipo 3 de endonucleasa?
Son asimétricos y cortan el ADN lejos (10-30pb) del sitio de reconocimiento.
Que vectores hay?
Plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos y cromosmas artificales.
Que son los plásmidos?
dsADN circulares pequeños separados del ADN cromosómico de las bacterias y levaduras. Dan características especiales. Albergan genes pequeños.
Que son los bacteriófagos?
Son virus que infectan a la bacterias. Son grandes y albergan genes grandes.
Los bacteriofagos pueden invadir el ADN cromosómico. Que se les hace para evitar esto?
Se eliminan sus genes que no se requieren para la replicación y empaquetamiento. De esta forma, solo invaden los plásmidos.
Que son los fagémidos?
Son plásmidos al que se le incoprora el origen de replicación de un fago. Se quea lineal dentro del bacteriofago = no tiene sitios cos.
Que son los cósmidos?
Se modifica un plásmido para albergan un gen más grande con la adición de sitios Cos en sus extremos.
Que son los cromosmas artificiales?
Se agarra una bacteria o levadura –> se extrae el ADN cromosómico –> se le pone del gen deseaso –> se inserta otra vez. Son cromosomas modificados.
Cual es el vector que también se le conoce como castor hibrido?
Los cosmidos
Que permiten los sitios Cos?
Permiten la plegación del plámido en su forma cirular dentro dell bacteriofago.
Que son los BAC y los YAC?
Son cromosomas artificales
- BAC: bacterias - procariotas.
- YAC: levaduras - eucariota.
En la clonación, que tipos de vectores se pueden usar?
Plásmidos, bacteriofagos, fagémidos y cósmidos.
Que hace la clonación?
Replican un gen de una célula. Almacenamiento de genes. ADN recombinante.
Cuales son los componentes necesarios para la clonación?
- Origen de replicación (ori)
- Sitio múltiple de clonación (SMC)
- Marcador de selección (Amp)
Que son las secuencias polindrómicas?
Son secuencias que se pueden leer igual bidireccionalmente.
Ejemplos de marcadores de selección
Resistencia de antibióticos, gen lacZ-beta-galactosidasa y colorante verde fluorescente.
Cuales son los pasos generales de la clonación? (7)
- Se corta el inserto que se va a clonar con una enzima de resticción tipo 2.
- Se corta el vector con la misma enzima de restricción –> desfosforila –> se purifica.
- Se une el inserto y el vector con una ligasa.
- Se pone glicerol al 10% y CaCl2 a células bacterianas para hacer su membrana temporalmente.
- Se introduce el ADN recombinante en la células competentes –> adquieren el gen exógeno –> nuevo fenotipo.
- Se ponen las células en un marcador de selección –> se identifican las células que han adquirido el ADN recombinante (sobreviven).
- El gen se replica –> produce proteínas o se almacenan los genes.
Que son las colonias transformantes?
Son las bacterias que han adquirido el ADn recombinante.
Cuales son los componentes de ADN recombinante por expresión?
- Origen de replicación (ori)
- Sitio múltiple de clonación (SMC)
- Marcador de selección (Amp)
- Promotor: secuencia de ADN que inicia la transcripción del gen insertado en el vector a ARNm.
- IRES o internal ribosome entry site: es una secuencia que permite la traducción de ARNm en los ribosomas.
- Secuencia de poliA: importante para al estbailidad y la exportación del ARNm del núcleo al citoplasma.
Qué es el origen de replicación (Ori)?
es donde se separan las hebras.
Qué es el sitio múltiple de clonación (SMC)?
Son las secuencias polindrómicas. Reconocido por llas enzimas de restricción para poser insertar el ADN complementario.
Que es el marcador de selección (Amp)?
Funciona para filtrar las bacterias que internalizan el plasmido de las que no. Las que si, sobreviven, las que no, mueren.
Que son los hibridomas?
Son células diseñadas para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades.
Cuales son los métodos para crear anticuerpos monoclonales?
- Tecnología de hibidroma
- ADN recombinante
- Ribosoma display
Como se producen los anticuerpos? (3)
- Linfocitos B en su etapa madura exprexan IgM e IgD.
- Se unen a un antígeno específico –> activación –> proliferación clonal –> se diferencian en células plasmáticas.
- Células plasmáticas secretan anticuerpos capaces de neutralizar al antígeno específico.
Cuales son las características de los anticuerpos monoclonales?
- Monovalentes
- Se unen a un epítopo (muy específicos)
- Son producidos por una clona de linfocitos B
Cuales son los pasos de producción de una nticuerpo monoclonal? (7)
- Los ratones son inmunizados con el antígeno de interés.
- Se activan y proliferan los linfocitos B en los ratones, producieendo anticuerpo específicos de este antígeno.
- Se extraen las células B del bazo.
- Las células B se fusionan con células de mieloma múltiple con técnicas como electrofusión o plietilenglicol.
- Las células se cultivan en un medio HAT durante 10-14 días. Solo las hibridas sobreviven.
- Las células hibridas se extraen y se cultivan en pocillos serpados y se analizan de forma individual.
- Las células híbridas se clonan in vivo o in vitro.
Como es la visualización de fagos?
Se inserta ADN del anticuerpo en el genoma del fago M13 (bacteriofago). Este recombinante infecta bacterias como E-coli para que presenten este anticuerpo monoclonal en su superficie.
Que es le tecnología del ribosoma display?
Se usa para la síntesis in vitro. Se ponen ribosomas, aminoácidos y un ARNm del anticuerpo deseado en un medio para que produza el acnitucerpo.. Puede ser 100% humano.
Hoy en día, como se producen los anticuerpos monoclonales?
Por tecnología ribosoma display
Que son los anticuerpos policlonales?
Son diversos anticuerpos rpoducidos por diversas copias de un linfocitos B. Cada uno puede reconocer diferentes antígenos = epítopes.
Al incio, los anticuerpos monoclonales se usaban para tratar que?
Linfoma
Cuales son los tipos de anticuerpos monoclonales?
- Murinos: terminan en -momab. 0% humanos, 100% ratón. Potencial inmunogénico alto → muerte.
- Quiméricos: terminan en -ximab. La región variable es murina, 66% humano. Potencial inmunogénico intermedio.
- Humanizados: terminan en -zumab. Solo la regiones hipervariables son murinas = 90% humano. Potencial inmunogénico bajo.
- Humanos: terminan en -mumab. Son 100% humanos. Potencial inmunogénico muy bajo.
Cuales son los mecanismos de acción de los anticuerpos monoclonales?
- Indirecto: se unen a recpetores superficiales
- Directo: se unen a porteínas.
Cual es la vía de administración de los anticuerpos monoclonales?
Vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
Por que se usan las células de mieloma múltiple para crear anticuerpos monoclonales?
Los mielomas son células de cáncer de plasma que se han vuelto inmortales y se pueden mantener en cultivo celular de manera indefinida.
Cual es la diferencia entre lso cnaitcupos monoclonales y los policlonales?
Los monoclonales vienen de una única línea celular de células plasmáticas que es clonada.
Los anticuerpos policlonales son producidos por múltiples líneas celulares y reconocen varios antígenos.
