Análisis de Ácidos Nucleicos Flashcards
2 mitad
Es el 1er paso para los estudios y técnicas de biología molecular, medicina forense, bioinformática, nanotecnologia de ADN.
Extracción de ADN
El tipo de extracción de ADN depende de? (3 factores)
- Tipo de ácido nucleico que se va a extraer (pj sdADN)
- Organismo de origen del acionucleotido (pj procariota)
- Fuente de los ácidosnucleotidos (pj sangre)
Cuales son las etapas de la extracción de ADN por la técnica de fenolclorofomo? (4)
- Lisis de células y liberación del ADN
- Extracción de proteínas y lípidos con solventes órganicos
- Precipitación de ADN
- Lavado de ADN
En que consiste el primer paso de la extracción del ADN por la técnica de fenoclorofomo?
Se rompen las células para la liberación del ADN. Se utilizan diferentes sustancias dependiendo de la célula:
- Lisis de eritrocitos: cloruro de amonio.
- Lisis de membranas celulares y nucleares: SDS (dodecilsulfato sódico)
En que consiste el segundo paso de la extracción del ADN por la técnica de fenoclorofomo?
Se extraen las proteínas y lípidos con solventes orgánicos como fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Esto va a dejar dos fases:
- Fase orgánica: lípidos, proteínas y debris celulares.
- Fase acuosa: ácidos nucleícos = ADN.
En que consiste el tercer paso de la extracción del ADN por la técnica de fenoclorofomo?
El ADN se precipita de la fase acuosa utilizando un agente precipitante como una solución salina saturada con etanol de 100%.
En que consiste el cuarto paso de la extracción del ADN por la técnica de fenoclorofomo?
Se elva el ADN con etanol del 70% y agua para eliminar cualquier residuo.
Que es la espectrofotometría y para que se usa?
Una solución es iluminada y mientras más luz se absorba (menos luz), mayor concentración de moléculas indica (inverso). Sirve para la cuantificación. Las proteínas abroben luz de 280nm. (fenol 270nm ?)
Que es la fluorometría?
Se agrega el colorante Hoechst 33258 fluorescente a unos ácidos nucelicos los cuales en respuesta, emiten una longitdud de onda superior a la que absorben. La concentración de moléculas es proporcional a la intensidad de emisión fluorescente.
Que sigifica PCR?
Reacción en cadena de la polimerasa.
Que hace la pcr? Para que sirve?
Esta replica para amplificar un segmento de ADN. Consiste en 30 a 40 ciclos. Se utiliza para identificar la presencia de un gen específico.
Para hacer una PCR, que debe de haber en la prueba? (componentes o material)
- Secuencia de ADN ya extraído (dsADN o cADN)
-Taq polimerasa para sintetizar ADN - Amortiguador: buffer con pH de 8.4.
- Cloruro de magnesio (MgCl2): cofactor de la polimerasa.
- Desoxirribonucleótidos (dNTP): dATP, dCTP, dTTP, dGTP.
- Primeras de ADN: se diseñan. Altos en GC (dificil de separar). Reconocen las secuencias blanco en el ADN molde.
Hay dos tipos de primers que se utilizan en una PCR. Cuales son estos?
- Forward: 5’ a 3’.
- Reverse: 3’ a 5’.
Que maquina se usa para hacer una PCR? Que produce cada ciclo?
En un termociclador para establecer un ambiente homogéneo. Cada ciclo produce 2 cadenas de ADN (se va multiplicando por 2).
Cuales son los tres pasos de una PCR?
Desnaturilización, hibridicación y extensión.
En que consiste el primer paso de una PCR?
El ADN es calentado a 95°C durante 20-30 segundos y después enfriado. Se rompen los puentes de hidrógeno –> se separan las hebras.
En que consiste el segundo paso de una PCR?
Los primeras se alinean al extremo 3’ del ADN e hibridan con su secuencia complementaria en un temperatura de 50-60°C (prueba y error; varía).
En que consiste el tercer paso de una PCR?
La Taq polimera agrega dNTPs complementarios a partir del primer, crando una nueva cadena en dirección 5’ a 3’ en una temperatura de 72°C.
Por que a fuerzas se tiene que usar una taq polimerasa en una PCR?
Porque la única bacteria con un ADN polimerasa que sobrevive los 95° C es la bacteria thermus aquaticus (taq).
Como se estima la temperatura que se debe de usar en el paso de hibridación de una PCR?
Con la ecuación: 4(G+C) + 2(A+T)
Que es una electroforesis?
Es una técnica que separa biomoléculas en disolución, en base a sus tamaños y carga eléctricas, al someterlas en un campo eléctrico. Se realiza al final de una PCR.
Cuales son los 3 componentes principales de una electroforesis?
La cámara de electroforesis, el gel de agarosa y el marcador de pesomolecular.
Que hace la cámara de electroforesis?
Genera un campo eléctrico alrededor del gel con dos polos que se conecta a un fuente de energía.
