HC.7 - Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
Wat is de beste maat voor de genexpressie en waarom?
De hoeveelheid (actief) eiwit is beter dan mRNA
Omdat mRNA zorgt voor meer dan alleen eiwitsynthese (kan ook inactief eiwit of eiwit dat meteen wordt afgebroken)
Wat is proteomics?
Bestudeert alle eiwitten van de cel
Waarvoor kan het expressie profiel voor een eiwit gebruikt worden?
Analyse: eiwit identificatie, modificatie en interactie mappen
Voor welke vier dingen kan massa spectrometrie (voor eiwitidentificatie) gebruikt worden?
- Eiwitten identificeren
- Eiwitten kwantificeren (iets moeilijker) = hoeveelheid
- Bindende eiwitten identificeren (zijn er eiwitten die binden aan eiwit van interesse)
- eiwitmodificaties identificeren
Wat zijn de vijf stappen van eiwit identificatie?
- Eiwit of eiwitmengsel
- Trypsine digestie (= protease): breekt eiwit op in kleine stukjes (trypsine zit ook in darm)
- Analyse met massa spectrometrie: massa meten van alle stukjes
- Datavergelijking (met humaan genoom project als database)
- Identificatie van het eiwit: als meerdere fragmenten matchen is kans groter dat het klopt
Hoe werkt de trypsine digestie van de eiwitten?
Knipt op specifieke pekken, voor Arginine (R) of voor Lysine (K) –> typische fragmenten (groot en klein)
Elk eiwit heeft een uniek patroon van stukjes (fingerprint)
Hoe werkt massa spectrometrie, noem de 9 stappen
- Sample plaat is + geladen
- Op sample plaat wordt een eiwit(mengsel) aangebracht
- Op mengsel schieten met laser puls
Gevolg: aantal fragmenten over in gas vorm –> krijgen positieve lading (elektronen wegschieten) - Plaat verderop is - geladen, zit gat in midden plaat
- Eiwit moleculen zijn nu + geladen en worden dus afgestoten door sample plaat en aangetrokken door andere plaat
- Molecuul vliegt door vacuumbuis
- Snelheid hangt af van de massa: hoe kleiner de massa, hoe eerder hij aankomt
- Detector vangt de moleculen op per tijdseenheid
- Kan massa heel precies bepalen en uitrekenen wat voor aminozuren erin zouden moet zitten
(1 dalton is gewicht van 1 H-atoom)
Wat is het humaan genoot project?
Database van menselijk genoom met alle mogelijke eiwitten en alle mogelijke tryptische fragmenten
Weten hiervan de molecuulmassa’s
Wat houdt de datavergelijking in?
De molecuulmassa’s van de gemeten eiwitten wordt vergeleken met die in het humaan genoom project
Hoe begint de identificatie van eiwit interacties/bindende eiwitten?
Antilichaam voor het eiwit waarvan je de interacties wil onderzoeken
Noem de stappen van het identificeren van bindende eiwitten
- Antilichaam toevoegen aan oplossing met eiwitten (hierin target eiwitten met gebonden eiwitten)
- Wegwassen ongebonden eiwitten
- massaspectrometrie
- Eiwitten in kaart brengen waardoor interacties ophelderen
Wat kan kan worden gedaan met de bekende eiwit interacties?
In een figuur zetten voor meer duidelijkheid over de complexe regulatie circuits in cellen
Gebruiken om genexpressie beter te begrijpen: wat betekent het als een eiwit meer/minder/niet aanwezig is vanwege de interacties
Hoe kunnen we eiwit modificaties onderzoeken?
- trypsine
- Peptiden verreiken met fosfaatgroep (hoeft niet, maakt wel makkelijker) = 80 dalton zwaarder (P)
- Massaspectrometrie
- Aan de hand van moleculaire massa kijken welke peptiden gefosforyleerd zijn
Kan ook met toevoeging van andere groepen
Wat is metabolics?
Analyse welke metabolieten voorkomen (bvb in bloed) –> bekijken wat een cel maakt
Wat is…..?
- Het genoom
- het transcriptoom
- het proteoom
- het metaboloom
Genoom: complete set van DNA
transcriptoom: complete set van RNA
Proteoom: complete set van eiwitten
Metaboloom: complete set metabolieten (suikers, nucleotiden, aminozuren)
Waarvoor kan de aanwezigheid van bepaalde metabolieten gebruikt worden?
Vroege detectie van tumoren doordat vanwege de deregulatie van de energievoorziening bepaalde metabolieten in een grote hoeveelheid voorkomen worden die normaal gesproken niet zo veel gemaakt worden
Noem de 6 stappen van het in kaart brengen van het metaboloom:
- Sample preparation: evt zuiveringsstap (maar zijn al in kleine stukjes)
- Aanbrengen op sample plaat
- massaspectrometrie
- identificatie met computer
- Herkennen patroon
- Wat is de biomarker?
Wat is een biomarker?
Een vlaggetje dat correleert met een ziektestatus
Waarom is mRNA iet altijd voorspellend voor de eiwitactiviteit?
Het zorgt Naast eiwitactiviteit ook voor:
1. regulatie van eiwitmodificaties (fosforylering, etc)
2. regulatie van eiwit stabiliteit (afbraak door bepaalde proteases)
3. regulatie van translatie (aantal mRNA dat eiwit wordt)
Waardoor wordt de translatie gereguleerd?
MicroRNA: korte stukjes RNA
Waar komen microRNA’s vandaan?
Gecodeerd in het DNA
Noem de stappen van de regulatie van de translatie door microRNA
- Van het DNA wordt een stukje RNA afgeschreven
- Drosha (enzymcoplex) in kern knipt het tot pre-miRNA
- Transport naar cytoplasma
- Dicer knipt het pre-miRNA tot miRNA = kort stukje dubbelstrengs RNA (ong 20 nucleo’s lang)
- 1 streng wordt ingebouwd in het RISC-complex
- Hierin kan het binden aan een complementaire sequentie in het mRNA
- Zo kan het ervoor zorgen dat
- Ribosomen de translatie niet opstarten op het RNA
- Dat het mRNA wordt afgebroken - Door de transcriptie van miRNA te reguleren wordt de translatie van mRNA gereguleerd
Wat is het gevolg van meer miRNA?
Minder eiwitten uit het passende stuk mRNA
Waar of niet waar
Een miRNA kan alleen maar een mRNA beïnvloeden
Niet waar
1 miRNA bindt vaak aan meerdere mRNA’s
1 mRNA bevat meerdere bindingsplekken voor miRNA’s
Waarvoor kan het analyseren van miRNA gebruikt worden in de oncologie?
Door met NGS of microarrays te kijken naar welke en hoeveel miRNA’s aanwezig zijn en wat hun expressieprofielen zijn kan worden gekeken naar of en hoe zij mogelijk invloed hebben op kanker-gerelateerde genen
Wat kan het analyseren van de expressieprofielen van het miRNA opleveren
Een goede diagnostische en prognostische waarde
Wat kan er nog meer in het RISC-complex worden ingebouwd?
Kleine/korte RNA’s die op een andere manier ontstaan (geen microRNA)
Wat zou ook in het RISC complex ingebouwd kunnen worden?
Zelf gemaakte RNA’s en dus zelf kiezen van target DNA gaat worden om bepaalde mRNA’s uit te schakelen
Wat gebeurt er als er een stukje dubbelstrengs RNA in de cel gebracht wordt?
- Dicer knipt het in korte stukjes = siRNA (short interference)
- Korte stukjes worden ingebouwd in het RISC-complex
- RISC-complex kan mRNA afbreken waartegen het korte stukje RNA tegen gericht is
Wat is de klinische toepassing van RNA-interferentie?
Voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor groei voor kankercellen tot expressie komen
Wat is een obstakel bij het gebruik van RNA-interferentie in de oncologie?
Het is lastig om het alleen in kankercellen te krijgen –> heeft vaak ook gevolgen voor gezonde cellen
Hoe kan men proberen om BCR-ABL te remmen?
Door het eiwitproduct weg te vangen
Wat zijn vier nadelen van het remmen van de kinase activiteit van BCR-ABL?
- Er is gemakkelijk resistentie
- Specificiteit van een remmer is vaak een probleem
- het zal vaak niet lukken een geschikte remmer te vinden
- pakt het probleem niet bij de bron aan (DNA)
Wat zijn 4 voordelen van RNAi?
- Heel eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waar je de sequentie van weet
- Zeer specifiek
- Door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
- Zeer geschikt voor hoge doorvoer analyses (RNAi libraries)
Noem twee nadelen van RNAi
- Kan in principe alleen gebruikt worden om expressie te remmen
- We weten nog niet hoe we het siRNA in de gewenste cellen moeten inbrengen
