HC.3 - Cytogenetische afwijkingen Flashcards
Waarvoor kan de cytogenetica gebruikt worden?
- Diagnostiek
- Prognose
- Respons op chemo
- identificeren van betrokken genen
Welke cytogenetische afwijking is gedefinieerd voor AML?
translocatie (8;21)
Komt niet bij andere ziektebeelden voor
Wat is een slecht prognostisch op chromosoom niveau?
Complexe karyotypes met veel afwijkingen
Wat zijn veel voorkomende cytogenetische afwijkingen bij AML?
t (8;21)
inv (16)
t (9;11)
Kan er een relatie zijn tussen moleculaire afwijkingen en cytogenetische afwijkingen?
Ja bepaalde afwijkingen komen vaker in combinatie voor
FLT3 komt vaak bij t (6;9) voor maar dit HOEFT niet
Wat zijn twee technieken voor de detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen?
- klassieke cytogenetica = banderingstechnieken
Grof - Moleculaire cytogenetica
a) FISH = fluorescente in situ hybridisatie
b) Array (SNP-array)
Wat is een element waar rekening mee gehouden moet worden bij cytogenetisch onderzoek?
Dat je delende cellen nodig hebt in de meta-fase om de chromosomen te kunnen zien
Wat wordt er gedaan als voorbereiding van cytogenetisch onderzoek?
- Beenmerg of bloed in kweek met groeifactoren om cellen aan te zetten tot deling
- 1-2 dagen kweken
- Mitose remmer geven (mitose blok) = colcemid: spoeldraden niet vormen of deze afbreken –> cellen worden –> bevroren in meta-fase
- hypotone oplossing toevoegen –> cellen gaan zwellen en kapot
- Kapotte cellen worden gefixeerd met methanol-azijnzuur waardoor membraan ontvet wordt
- Druppelen van de suspensie op het glaasje –> membranen bereken
- Bandering: R, G of Q
Wat is het effect van bandering?
Elk chromosoom heeft zijn eigen unieke streepjescode welke te zien is
Waar ligt het centromeer?
De ligging van het centromeer is voor elk chromosoom uniek
Waaruit bestaat een chromosoom?
- Centromeer
- korte arm = P-arm
- lange arm = Q-arm
Waar zitten de P-arm en de Q-arm?
P-arm zit boven
Q-arm zit onder
Welke chromosomen hebben geen P-arm en wat hebben zij hiervoor dan in de plaats?
13, 14, 15, 20 en 21
repetitieve DNA-sequentie voor het ribosomale DNA
Wat gebeurt er ribosomaal DNA verloren gaat?
Vaak geen consequenties omdat de DNA-sequenties op meerdere plekken aanwezig is
Noem drie gebalanceerde structurele chromosoom afwijkingen?
- translocatie: 2 stukken chromosomaal materiaal uitgewisseld
- inversie: stuk van DNA is 180 graden gedraaid
- Insertie: een interstitieel stukje is verplaats
Noem twee soorten inversies in chromosomen
- parecentrisch: aan een arm van een chromosoom (dus in de p-arm of q-arm)
- pericentrisch: over het centromeer heen
Noem vier soorten niet-gebalanceerde chromosomale afwijkingen
- Deletie: een deel van het chromosoom is verloren gegaan
- amplificatie: duplicatie
- niet-gebalanceerde translocatie
- eenmutatie: basepaar niveau, niet zien met microscoop
Noem twee soorten chromosomale deleties
- terminale deletie: uiteinde chromosoom
- interstitiele deletie: in midden chromosoom
Hoe wordt een karyogram weergegeven?
- chromosoom aantal
- geslacht
- bijzonderheden
Wat betekent het karyotype: 45, XY, -7 [10]?
Er zijn 45 chromosomen
het gaat om een man
chromosoom 7 mist in 10 metafasen
Wat betekent [ ] in het karyotype?
De hoeveelheid meta-fases waarin de afwijking gezien is
Hoe geven breukpunten weer?
Afwijking (chromosoom/chromosomen) (arm chr 1 met plek; arm chr 2 met plek)
Wat betekent t (9;11) (p22;q23)?
Er is sprake van een translocatie tussen chromosoom 9 en 11
Op chromosoom 9 zit het breekpunt op de p-arm op plek 22
Op chromosoom 11 zit het breekpunt op de q-arm op plek 23
Hoe kunnen translocaties worden gezien?
Een stuk kleurt feller of minder fel aan
Maar kan ook nauwelijks/niet te zien zijn
Wat is een complex karyotype? Wat zegt dit over de prognose?
Er zijn meerdere afwijkingen
Dit is een slechte prognose
Wat is een monosomaal karyotype? Wat zegt dit over de prognose?
- Verlies van twee autosomen (niet geslachtschromosomen) OF
-1 monosomie EN een structurele afwijking
Zeer slechte prognose: overal survival 7%
Monosomie = verlies van een chromosoom
Waarvoor kan FISH gebruikt worden?
Mutaties zichtbaar maken –> gericht op een specifiek target
Bvb. p53 op chr 17
Wat is het stappenplan van een FISH?
- Denaturatie van DNA (warmte)
- Probe met fluorescerend label bij DNA voegen (laten sudderen nachtje)
- Probe zoekt tegenhanger in DNA –> hecht aan het DNA
- Bekijken met microscoop: stipje zichtbaar in kern als probe is gebonden aan het DNA
Wat kan je met een FISH?
Aantonen of een stukje DNA aanwezig is
Wat zijn twee soorten van FISH en waarbij worden deze gebruikt?
- Metafase FISH op chromosomen bij lymfocyten, leukocyten, solide tumoren
- Interfase FISH: kernen van niet/slecht delende cellen
Noem de 5 voordelen van FISH?
- Kleine dingen aantonen (niet zo klein als moleculair)
- Breukpunten makkelijk aantonen
- moeilijke zichtbare translocaties en complexe genoom veranderingen zien
- relatief kleine hoeveelheid afwijkende cellen nodig
- Snelle diagnostische detectie op kernen in de interfase
Wat zijn drie nadelen van FISH?
- beperkte sensitiviteit (omdat probe kiezen)
- alleen antwoord op gestelde vraag
- niet te veel targets tegelijk doen –> oog maar gevoeliger voor beperkte kleuren
Noem twee typen probes die gebruikt kunnen worden bij FISH
- Fusie proces
- breuk apart probes
Leg het principe van fusie-probe uit
Voorbeeld: stukje op chr 18 is groen en stukje op 19 is rood
Normaal: 2 rode stukjes of 2 groene stukjes (2 kopieën van elk chromosoom)
Translocatie: rood en groen stukje gaan naast elkaar liggen –> ziet er geel uit
Je hebt een fusie-signaal –> kleuren van betrokken genen fuseren en geven ander kleur signaal
Voor het aantonen van wat voor soort afwijkingen kan een fusie-probe gebruikt worden?
Translocaties
Wat is een risico bij het gebruik van de fusie-probe?
CO-lokalisatie = vals positiviteit
DNA is 3D structuur –> microscoop is 2D –> kunnen over elkaar heen projecteren/liggen waardoor onterecht geel signaal krijgen
Wat kan je doen om de kans op co-lokalisatie bij de fusie-probe zo klein mogelijk te maken?
In genoeg kernen/cellen kijken
Wat doen we in de praktijk vaak om co-lokalisatie te voorkomen?
Jewel-colour jewel fusion
Hierdoor twee fusies zien –> afwijkende 18 en afwijkende 14
Leg het principe van de break-apart probe uit
- Probe met kleurtjes aan weerszijden van een gen
- Als gen niet gebroken krijg je gefuseerde kleur = geel
- Bij translocatie verplaatst groene signaal naar chr 14 en blijft ander op chr 18
- Hierdoor apart rood en groen signaal zichtbaar
Met een geel signaal voor andere chromosoom
Wanneer gebruiken we de break apart probe?
Bij genen die vaak betrokken zijn allerlei translocaties
Mutatie die heel veel partners heeft
Wat gebeurt er bij toepassing van een break apart probe als er een ongebalanceerde translocatie heeft plaatsgevonden?
Een van de signalen is verdwenen dus alleen nog maar rood of groen
Wat maakt cytogenetisch onderzoek bij multipel myeloom zo lastig?
Cellen zijn niet in deling
Laag % afwijkende cellen in beenmerg aspiraat
Aantal chromosomale afwijkingen zijn niet zichtbaar
Wat is er vaak te zien bij karyotypering bij multipel myeloom?
Normaal karyotype
Kunnen er bij multipel myeloom afwijkingen gezien worden bij FISH?
Ja, maar wel laag %
Maar op interfase kernen
Welk chromosoom is vaak betrokken bij multipel myeloom?
14
Waar bevinden zich de afwijkingen bij multipel myeloom?
De grote plasmacellen –> niet in deling
Wat is een oplossing voor (cyto)genetisch onderzoek bij multipel myeloom?
Zuivering van plasma –> hoger % plasmacellen
Hoe werkt een zuivering van het plasma?
- erytrocyten verwijderd –> rode bloedcel lysis
- buitenkant (met name maligne) plasmacellen zit CD-138 marker
- antilichaam met magnetische bolletjes
- magneet erbij houden
- plasmacellen blijven over
- vervolgens beter een FISH toepassen bijvoorbeeld
Waarvoor kan een array gebruikt worden?
Ongebalanceerde afwijkingen eerder en makkelijker detecteren
Waar staat SNP voor?
Single nucleotide polymorphism
wat wordt er toegevoegd bij een array?
Heel veel probes
Waar kunnen we op testen met een array?
Of iemand homozygoot of heterozygoot is
Dus of iemand dezelfde of een andere nucleotide op het andere chromosoom heeft
Als een gezond persoon allel A en allel B heeft. Welke combinaties heeft deze persoon dan?
AA
AB
BB
Wat is de logR bij een array?
Een maat voor aantal kopieën dat aanwezig is
Waarmee wordt de array analyse gedaan?
B-allele frequentie en logR
Wat is de B-allele frequentie?
zegt iets over de frequentie van de SNP
Wat betekent LogR = 0?
Dat er twee kopieën zijn = normaal patroon namelijk diploïd
Wat is de uitslag bij de B-allele frequentie bij een normaal patroon?
Drie lijnen
Eentje bij AA, een bij AB en een bij BB
Wat is het verwachte patroon op de array bij een deletie?
De logR: zakt want er is nog maar 1 kopie –> streepje gaat omlaag
B-allele frequentie: laat alleen nog maar AA of BB zien omdat je nog maar 1 kopie hebt –> ziet dus twee lijnen (middelste is weg)
Wat is het verwachte patroon op de array bij een duplicatie?
LogR: gaat omhoog –> 3 kopieën –> streepje gaat omhoog
B-allele frequentie: Lijn erbij krijgen
Als +A: blijft onderin
Als + B: iets naar boven
Wat is het verwachte patroon op de array bij LOH?
LogR: normaal –> lijn dus in midden zoals normaal
B-allele frequentie: geeft patroon van deletie weer –> AB lijn is weg dus nog maar twee lijnen over (bij AA en bij BB)
Kan gebeuren als kopieën identiek zijn
Op centromeer geen probes dus ziet witte lijn
Wat kan er nog meer afgelezen worden uit de B-allele frequentie?
Mate van aanwezigheid, dus bij hoeveel % van de cellen komt het voor
Aan de zijkant aflezen dat bijvoorbeeld 70% van cellen het heeft
Wat gebeurt er als 100% van de cellen de afwijkende B-allele frequentie hebben?
Dan gaan lijnen helemaal naar buiten
Bij welke methode (FISH (alleen targeted) of SNP-array (alleen ongebalanceerd)) is de volgende afwijking te zien:
Translocatie
FISH: ja
SNP-array: nee
Bij welke methode (FISH (alleen targeted) of SNP-array (alleen ongebalanceerd)) is de volgende afwijking te zien:
Winst van een chromosoom
FISH: ja
SNP-array: ja
Bij welke methode (FISH (alleen targeted) of SNP-array (alleen ongebalanceerd)) is de volgende afwijking te zien:
deleties
FISH: ja
SNP-array: ja
Bij welke methode (FISH (alleen targeted) of SNP-array (alleen ongebalanceerd)) is de volgende afwijking te zien:
gains
FISH: ja
SNP-array: ja
Bij welke methode (FISH (alleen targeted) of SNP-array (alleen ongebalanceerd)) is de volgende afwijking te zien:
LOH
FISH: nee
SNP-array: ja
Wat is een SNP?
Een Variatie in het DNA (=polymorfie) van 1 nucleotide. Op een plaats in het genoom kan bij verschillende mensen een andere nucleotide worden aangetroffen. Het gaat om de hoeveelheid dat de SNP in een populatie wordt aangetroffen.
