Grupp 7 - Long PCR och kloning av stora fragment

Question 1

Vad används long PCR för?

Answer 1

Att amplifiera DNA-fragment större än 5kb

Question 2

Ge exempel på 3 användningsområden

Answer 2

1) Genotypning
2) DNA-sekvensering av långa fragment
3) Identifiera DNA från brottsplatser

Question 3

Vilka reagenser behövs till long PCR?

Answer 3

Primer, templat, dNTP, DNA-polymeras, Buffert med Mg,

Question 4

Hur skiljer sig primers vid long PCR från vanlig PCR?

Answer 4

• Generellt längre (22-30nt)

- Anpassade till högre annealingtemperaturer (58-68 grader)

Question 5

Hur mycket templat behövs?

Answer 5

50-300ng, men exakt mängd beror på källan

Question 6

Ska dNTP-koncentrationen vara hög eller låg? varför?

Answer 6

Hög. Eftersom långa fragment ska byggas behövs högre mängd dNTPs.

Question 7

Vilka egenskaper måste DNA-polymeraset ha? Varför blandas ofta en av varje typ?

Answer 7

• Hög fidelity (noggrannhet), har exonukleasaktivitet och proofreadingfunktion
• Hög processivitet, dvs kan syntetisera långa sekvenser innan det lossnar från DNA:t

Man blandar ofta ett av varje då det är svårt att hitta ett som uppfyller båda

Question 8

Hur skiljer sig bufferten i long PCR från vanlig PCR?

Answer 8

Den har högre magnesiumhalt. Magnesiumet är kofaktor till DNA-polymeraset och hjälper till vid inbindning av primers och nukleotider

Question 9

Vad är depurinering? När kan det ske?

Answer 9

Det är en DNA-skada som orsakas av höga temperaturer eller låga pH-värden.

Det som händer är att kvävebasen lossnar.

Question 10

Hur skiljer sig PCR-cykeln vid long PCR från vanlig PCR?

Answer 10

• Elongeringsfasen sker i två omgångar (10 cykler + 25 cykler)
• Elongeringsfasen är längre (extra tid) och ofta läggs extra elongeringstid till på slutet (20 min)
• Annealing- och denatureringstemperaturerna är högre och därför måste tiderna hållas korta

Question 11

Vad är hot start?

Answer 11

En metod som tillämpas för att undvika ospecifika PCR-produkter. Det görs genom att vissa reagensers inte tillsätts förrän körningen når optimal temperatur.

Framförallt är det DNA-polymeraset som tillsätts sent

Question 12

Beskriv tre metoder för hot start

Answer 12

1) Antikropp som binder till polymeraset och hindrar dess aktivitet tills temperaturen blir så hög att den degraderas (ca 70 grader)
2) Sen tillsättning av polymeraset - vänta tills resterande reagens nått 95 grader
3) förvärm PCR-maskinen till 95 grader medan resterande reagens förbereds på is

Question 13

Hur kan man minimera depurinering pga höga temperaturer?

Answer 13

Genom att använda tunna PCR-rör samt små reaktionsvolymer kan man se till att temperaturförändringar sker snabbt och minimerar därmed tid vid höga temperaturer

Question 14

Vilka viktiga egenskaper måste en vektor ha? (3st)

Answer 14

1) Origin of replication - ett ställe på DNA:t där replikationen ska starta
2) Selektionsmarkörer/reportergener: ger ett sätt att särskilja de celler som tagit upp vektorn
3) Restriction site: ställe på DNA:t där klyvningsenzymerna kan klippa itu så att främmande DNA kan sättas in (OBS endast ett site per enzym!)

Question 15

Beskriv en plasmid samt förklara om de är lämpliga för att klona fragment på 20kb

Answer 15

• Ofta från E. coli
• Cirkulärt DNA
• Kräver kompetenta bakterier
• Vanligaste typen vid kloning av mindre DNA-fragment, används i praktiken inte för fragment över 10kb.

Question 16

Vad är lambda-fager?

Answer 16

En typ av bakteriofag (virus som endast infekterar bakterier) som är specifik för E. coli

Question 17

Förklara kort den lytiska och lysogena vägen

Answer 17

I den lytiska vägen går fagen in i bakterien och börjar replikera sig själv tills att cellen sprängs

I den lysogena vägen integreras fagens genom i värdcellens och replikeras därmed tillsammans med vär-genomet. Kan aktiveras och gå in i lytiska vägen

Question 18

Kräver lambda-fager selektionsmarkörer? Varför/varför inte?

Answer 18

Nej. De är så pass effektiva att föra in DNA:t i bakterierna att det är nästan garanterat att lyckas om fagen tagit upp insert. Om de inte tagit upp något insert blir de inte funktionella fager.

Question 19

Vilka två lambda-fager finns? Vad styr vilken fag som används?

Answer 19

Insertion vectors: används när man har fragment som är så pass litet att det inte överstiger fagens maxkapacitet (kan endast föra in några extra kilobaser utöver sitt eget genom)

Ersättningsvektorer: används vid större fragment. Delar av fagens genom byts ut mot det fragment man vill klona.

Question 20

Vad är en kosmid?

Answer 20

En plasmid med cos-säte. De kombinerar egenskaper från plasmider och lambda fager

Question 21

Vilken egenskap har kosmiden tagit från plasmiden respektive lambda fagen?

Answer 21

De replikeras på samma sätt som plasmider

De använder Cos-säten från lambda-DNA så att de kan packas in i lambda fager och använda dem som transportsätt in i bakterierna

Question 22

Kosmider kan ta insert på 37-52kb, men de har en begränsning för sina insert. Vilken? Vad beror det på?

Answer 22

De kan inte ta fragment mindre än 37kb. Om ens fragment är mindre så måste “extrautrymmet” fyllas ut.

Anledningen är att kosmiden annars inte kan packas in i fagpartiklarna ordentligt och då blir det inga funktionella fager som kan föra in den i bakterien

Question 23

Kan nya viruspartiklar bildas av kosmider som packats in i fagpartiklar?

Answer 23

Nej. De har inte lambda-generna nödvändiga för att kunna gå in i den lytiska/lysogena fasen

Question 24

Behövs selektionsmarkörer när man använder kosmider?

Answer 24

Ja. Ofta används ampicillinresistens.