Grupp 7 - Long PCR och kloning av stora fragment Flashcards
Vad används long PCR för?
Att amplifiera DNA-fragment större än 5kb
Ge exempel på 3 användningsområden
1) Genotypning
2) DNA-sekvensering av långa fragment
3) Identifiera DNA från brottsplatser
Vilka reagenser behövs till long PCR?
Primer, templat, dNTP, DNA-polymeras, Buffert med Mg,
Hur skiljer sig primers vid long PCR från vanlig PCR?
- Generellt längre (22-30nt)
- Anpassade till högre annealingtemperaturer (58-68 grader)
Hur mycket templat behövs?
50-300ng, men exakt mängd beror på källan
Ska dNTP-koncentrationen vara hög eller låg? varför?
Hög. Eftersom långa fragment ska byggas behövs högre mängd dNTPs.
Vilka egenskaper måste DNA-polymeraset ha? Varför blandas ofta en av varje typ?
- Hög fidelity (noggrannhet), har exonukleasaktivitet och proofreadingfunktion
- Hög processivitet, dvs kan syntetisera långa sekvenser innan det lossnar från DNA:t
Man blandar ofta ett av varje då det är svårt att hitta ett som uppfyller båda
Hur skiljer sig bufferten i long PCR från vanlig PCR?
Den har högre magnesiumhalt. Magnesiumet är kofaktor till DNA-polymeraset och hjälper till vid inbindning av primers och nukleotider
Vad är depurinering? När kan det ske?
Det är en DNA-skada som orsakas av höga temperaturer eller låga pH-värden.
Det som händer är att kvävebasen lossnar.
Hur skiljer sig PCR-cykeln vid long PCR från vanlig PCR?
- Elongeringsfasen sker i två omgångar (10 cykler + 25 cykler)
- Elongeringsfasen är längre (extra tid) och ofta läggs extra elongeringstid till på slutet (20 min)
- Annealing- och denatureringstemperaturerna är högre och därför måste tiderna hållas korta
Vad är hot start?
En metod som tillämpas för att undvika ospecifika PCR-produkter. Det görs genom att vissa reagensers inte tillsätts förrän körningen når optimal temperatur.
Framförallt är det DNA-polymeraset som tillsätts sent
Beskriv tre metoder för hot start
1) Antikropp som binder till polymeraset och hindrar dess aktivitet tills temperaturen blir så hög att den degraderas (ca 70 grader)
2) Sen tillsättning av polymeraset - vänta tills resterande reagens nått 95 grader
3) förvärm PCR-maskinen till 95 grader medan resterande reagens förbereds på is
Hur kan man minimera depurinering pga höga temperaturer?
Genom att använda tunna PCR-rör samt små reaktionsvolymer kan man se till att temperaturförändringar sker snabbt och minimerar därmed tid vid höga temperaturer
Vilka viktiga egenskaper måste en vektor ha? (3st)
1) Origin of replication - ett ställe på DNA:t där replikationen ska starta
2) Selektionsmarkörer/reportergener: ger ett sätt att särskilja de celler som tagit upp vektorn
3) Restriction site: ställe på DNA:t där klyvningsenzymerna kan klippa itu så att främmande DNA kan sättas in (OBS endast ett site per enzym!)
Beskriv en plasmid samt förklara om de är lämpliga för att klona fragment på 20kb
- Ofta från E. coli
- Cirkulärt DNA
- Kräver kompetenta bakterier
- Vanligaste typen vid kloning av mindre DNA-fragment, används i praktiken inte för fragment över 10kb.
Vad är lambda-fager?
En typ av bakteriofag (virus som endast infekterar bakterier) som är specifik för E. coli
Förklara kort den lytiska och lysogena vägen
I den lytiska vägen går fagen in i bakterien och börjar replikera sig själv tills att cellen sprängs
I den lysogena vägen integreras fagens genom i värdcellens och replikeras därmed tillsammans med vär-genomet. Kan aktiveras och gå in i lytiska vägen
Kräver lambda-fager selektionsmarkörer? Varför/varför inte?
Nej. De är så pass effektiva att föra in DNA:t i bakterierna att det är nästan garanterat att lyckas om fagen tagit upp insert. Om de inte tagit upp något insert blir de inte funktionella fager.
Vilka två lambda-fager finns? Vad styr vilken fag som används?
Insertion vectors: används när man har fragment som är så pass litet att det inte överstiger fagens maxkapacitet (kan endast föra in några extra kilobaser utöver sitt eget genom)
Ersättningsvektorer: används vid större fragment. Delar av fagens genom byts ut mot det fragment man vill klona.
Vad är en kosmid?
En plasmid med cos-säte. De kombinerar egenskaper från plasmider och lambda fager
Vilken egenskap har kosmiden tagit från plasmiden respektive lambda fagen?
De replikeras på samma sätt som plasmider
De använder Cos-säten från lambda-DNA så att de kan packas in i lambda fager och använda dem som transportsätt in i bakterierna
Kosmider kan ta insert på 37-52kb, men de har en begränsning för sina insert. Vilken? Vad beror det på?
De kan inte ta fragment mindre än 37kb. Om ens fragment är mindre så måste “extrautrymmet” fyllas ut.
Anledningen är att kosmiden annars inte kan packas in i fagpartiklarna ordentligt och då blir det inga funktionella fager som kan föra in den i bakterien
Kan nya viruspartiklar bildas av kosmider som packats in i fagpartiklar?
Nej. De har inte lambda-generna nödvändiga för att kunna gå in i den lytiska/lysogena fasen
Behövs selektionsmarkörer när man använder kosmider?
Ja. Ofta används ampicillinresistens.
