Genkloning (bakterier), restriktionsenzym, plasmider, DNA-elektrofores Flashcards
Definiera “kloning”
Kloning innebär skapandet av genetiska kopior av en individ/cell/gen.
Vilka sorters artificiell kloning finns det? (3st)
- Reproduktiv kloning (kloning i äggcell)
- Terapeutisk kloning (stamceller)
- Molekylär kloning (genkloning)
Nämn de 4 övergripande stegen för molekylär kloning av humana gener i bakterier
1: Klyv det humana DNA:t samt bakterieplasmiden med restriktionsenzym
2: Ligera det humana DNA:t med plasmiden
3: Transformera in den rekombinanta plasmiden i bakterier
4: selektera de bakterier som producerar det humana proteinet (de som har rekombinanta plasmider)
Vad är syftet med restriktionsenzymer/nukleaser?
De klipper ut den DNA-sekvens man vill ha genom att hydrolysera fosfodiesterasbindningar
Vad är syftet med plasmiden?
De är vektorer och fungerar som en värd för DNA-fragmentet man vill klona
Vad används Elektrofores av DNA till vid kloning?
Analys av DNA-fragmenten
Vad sker vid ligering?
DNA-fragmenten klistras ihop
Vad är en rekombinant plasmid?
En plasmid med insatt humant DNA
Vilka två sorters nukleaser/restriktionsenzym finns?
Endonukleaser, exonukleaser
Var klipper endonukleaser DNA:t?
I mitten/inne i DNA:t. De klyver sekvensen i två
Var klipper exonukleaser DNA:t?
De klipper i ändarna av sekvensen. De gör sekvensen kortare.
Det finns tre typer av endonukleaser, typ 1, 2 och 3. Vilken används för kloning?
Typ 2
Beskriv hur typ 2 endonukleaset vet var det ska klyva DNA:t
Det har en specifik igenkänningssekvens där det klyver DNA:t. Sekvensen är ett palindrom, dvs det är symmetriskt fram- och baklänges - exempel:
5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’
Ge exempel på några restriktionsenzymer (förkortningarna)
Hae III Taq I Hha I EcoRI EcoRV Pst I
Vilka två sorters plasmider kan bildas vid ligeringen?
Rekombinanta plasmider (human+bakterie) och vanliga plasmider (endast bakterie)
Vad är en kloningsvektor?
En DNA-molekyl som kan användas för att föra in främmande DNA i en cell
Vilka två DNA-molekyler uppfyller kraven för att kunna användas som kloningsvektorer?
Plasmider och viruskromosomer
Vilka krav finns för kloningsvektorer? 4st
- Måste kunna komma in i värdcellen
- Måste kunna replikeras inne i cellen för att producera flera kopior av sig själv
- Polylinker (MCS)
- Selektionsmarkörer (reportergener)
Vilka två sätt kan plasmiden finnas i bakterien efter transformeringen?
1: Replikering. Plasmiden finns löst i bakteriecytoplasman
2: Integreration: Plasmiden integreras i bakteriens kromosom. Fördelaktigt då det gör plasmiden mer stabil
Hur används polylinker?
Den syntetiska polylinkern legeras ihop med en plasmid för att konstruera en användbar kloningsvektor
Beskriv polylinker - vilka egenskaper har den?
- Många MCS är bra, men inte mer än ett igenkänningsställe
- 50-100 bp
Vad innebär egenskapen multiple cloning sites (MCS)?
Att DNA-sekvensen har många sites för restriktionsenzym av olika typer att binda in till
Vad för olika selektionsmarkörer finns? (2st)
Antibiotikaresistensgener och reportergener
Vad är syftet med selektionsmarkörer?
Att hitta och isolera de kolonier/celler som tagit upp plasmiden
Hur fungerar antibiotikaresistensgener som selektionsmarkörer?
Om man ger bakterien resistens mot antibiotika samtidigt med DNA-segmentet man vill klona kan man odla på antibiotikainnehållande medium och döda alla bakterier som inte tagit upp den rekombinanta plasmiden
Vad är en reportergen?
En DNA-sekvens som kodar för ett protein som lätt kan påvisas
Vilka egenskaper bör en reportergen ha
- Koda för protein som lätt kan påvisas
- Bör ej förekomma naturligt i den organism man ska föra in reportergenen i
- Kan fungera för sig själv eller kopplas till en annan gen (den man vill studera) så att de uttrycks tillsammans
Ge exempel på användningsområden för reportergener
- Man kan kontrollera hur framgångsrikt ett kloningsförsök är
- Man kan sätta in sekvenser framför reportergenen och undersöka om de fungerar som promotorer (och isf hur starka de är)
- Man kan undersöka hur effektivt genen translateras eller följa vart genprodukten tar vägen i cellen
Ge exempel på proteiner som kodas av reportergener och hur man kan påvisa dem
GAL/lacZ (beta-galaktosidas): hydrolyserar färglösa galaktosider till färgade produkter
LUC (Lucideras): oxiderar luciferin varvid fotoner emitteras
GFP (green fluorescent protein): fluorescerar vid UV-bestrålning
CAT (kloramfenikolacetyltransferas): överför acetylgrupper till kloramfenikol - kan ge antibiotikaresistens mot kloramfenikol
Hur kan man ligera in främmande DNA i en plasmid och sedan välja ut de plasmider som fått insert?
1: plasmid innehållande ampicillin- + tetracillinresistens klyvs vid ampicillin-res-genen (tar bort ampicillinresistensen)
2: Främmande DNA ligeras till plasmiden med DNA-ligas
3: Plasmiden förs in i E. coli som sedan odlas på tetracyklininnehållande agar - selekterar fram de som tagit upp plasmid
4: Överför kolonier till matchande platser på plattor med a) tetracyklin och b) tetracyklin + ampicillin
5: Se vilka kolonier som INTE växt på platta b) - dessa har tagit upp rekombinanta plasmider.
Vad är skillnaden mellan transformering och transfektion?
Transformering: När en bakterie tar upp DNA från omgivningen (naturlig process). Bakterien måste vara kompetent eller göras kompetent
Transfektion: När man överför DNA till en human/däggdjurscell
Hur används lacZ/betagalaktosidas som reportergen? Vilken skillnad kan observeras hos de bakterier som fått insert och inte?
Efter transformation odlas bakterierna på agar innehållande X-gal och IPTG.
Insert: växer med vita kolonier
Ingen insert: växer med blå kolonier
Hur påverkar pUC-plasmiderna med lacZ-genen E. colis beta-galaktosidasmolekyler? Hur ser de ut i vanliga E. coli?
+++++++
Vanliga E. coli har ofullständiga lacZ-gener och producerar därmed ofullständiga betagalaktosidasmolekyler utan normal N-terminal –> ofunktionellt enzym
pUC-plasmider med lacZ-genen kodar för en liten del av betagalaktosidasets N-terminal, och ger därför upphov till små betagalaktosidasfragment (alfa-peptider) som gör betagalaktosidasmolekylerna hela –> ger funktionellt enzym
Vad är X-gal och hur fungerar det?
+++++
Det är en galaktosanalog som kan användas som substrat av betagalaktosidasenzymet.
Hur bestäms bassekvensen av E. coli efter kloning?
Lambda-DNA klyvs i många fragment av olika storlek och ligeras i plasmider. Efter transformation renas plasmid fram ur en av kolonierna och klyvs med restriktionsenzym för att separera lambda-DNA:t från plasmiden och det undersöks med gelelektrofores för att se om det fanns ett insert och isf hur stort det var.
Sekvensering visar vilken del av lambda-DNA:t som satt i plasmiden
Vilka steg ingår i klyvning av DNA med restriktionsenzym? (5 steg)
- Börja med 1 mikrogram (ug) DNA i 23ug vatten
- Tillsätt vatten och RE till en totalvolym av 50ul
- Inkubera i 37 grader 1-2h
- Upphetta till 65 (alt 80) grader i 10-15 min
- Ta ut ett prov för att kontrollera att klyvningen fungerat
Hur går gelelektrofores till?
Ett DNA-prov laddas i brunnar på gel (vid minuspolen) ofta innehållande etidiumbrotid, ström appliceras och fragmenten börjar färdas mot pluspolen
Vad separerar DNA-elektrofores fragmenten baserat på?
Storlek eller konformation (cirkulär/linjär)
Hur påverkar geltätheten separationen av DNA-fragmenten?
Tätare gel separerar mindre fragment då större fragment har svårt att ta sig igenom gelen och fastnar vid brunnen.
Vad används etidiumbrotid till?
Visualisering av DNA:t. Det binder i DNA:t mellan basparen (intercalering). Vid belysning med UV-ljus lyser DNA:t med gul färg.
OBS: cancerframkallande
Vilket ämne kan användas istället för etidiumbrotid och hur farligt är det?
GelStar, ofarligt
Hur påverkas mängden fragment av tillsatsen av olika RE?
Det blir olika mängd fragment beroende på antal igenkänningsställen som RE har.
Hur vandrar de olika konformationerna av plasmid-DNA i gelen?
Mer relaxerade former av DNA:t (cirkulärt) vandrar långsammare än de supercoilade formerna.
