Grupp 3 - qPCR

Question 1

Jämför qPCR med vanlig PCR (5 skillnader)

Answer 1

• Detektion i realtid
• Mer känslig och selektiv
• Snabbare
• Mindre risk för kontamination
• Kan kvantifiera

Question 2

Vilka reagenser krävs för qPCR?

Answer 2

Primers, DNA-polymeras, dNTP, prober/sybr green

Question 3

Vilka tre stadier finns i PCR-cykeln och vid vilka temperaturer?

Answer 3

1) Denaturering - 95 grader
2) Annealing - 55-65 grader
3) Elongering - 72 grader

Question 4

Hur fungerar TaqMan-probe?

Answer 4

Det är en prob som innehåller fluorofor + quencher. Den binder in mellan primers. När de är ihopbundna tystar quenchern ner fluorescensen men när de är delas av polymeraset avges fluorescens.

Question 5

Vad visar CT-värde?

Answer 5

Det ger ett mått på hur många cykler som krävs för att detektera målsekvensen

Question 6

Beskriv semikvantitativt, relativ kvantifiering och absolut kvantifiering

Answer 6

Semikvantitativt ger en antydan om lite/mycket

Relativ kvantifiering ger ett relativt värde

Absolut ger ett exakt värde. Kräver standardkurva

Question 7

Hur fungerar SYBR green?

Answer 7

Binder allt dubbelsträngat DNA och absorberar ljus vid 497nm. Bundna molekyler lyser starkare än obundna.

Kan användas som ett billigare, enklare alternativ till probe-baserad PCR, men är mindre specifikt.

Question 8

Hur gör man en smältpunktsanalys?

Answer 8

Efter qPCR görs detta för att kontrollera att man inte har biprodukter tex primer dimerer.

Värme denaturerar DNA:t som släpper SYBR green –> mindre fluorescens. Mäter temperaturen där fluorescensen minskat till hälften, dvs där hälften av DNA:t denaturerats. På en graf bör endast EN topp synas, annars finns kontamination.

Question 9

Hur kan muterat DNA ge upphov till högre smältpunkt?

Answer 9

Om en/flera baser bytts ut från A/T mot G eller C

Question 10

Beskriv RT-qPCR

Answer 10

Det är en qPCR-metod som detekterar och kvantifierar RNA-sekvenser. Detta görs mha enzymet reverse transcriptase som omvandlar RNA till cDNA.

Question 11

Vad skiljer sig mellan 1-step och 2-step RT-qPCR?

Answer 11

Antalet provrör. I 1-step tillsätts alla reagenser i samma rör, medan i 2-step tillsätts först reagenserna för att bilda cDNA i ett rör, och sedan överförs cDNA till nästa rör samt DNA pol, extra buffert samt nya primers.

Question 12

Vilka fördelar och nackdelar finns med probe baserad qPCR? Nämn 2 av varje

Answer 12

Fördelar

• Mer specifik (fluorescenssignal uppstår när probe+targetsekvens interagerar)
• Multiplexdetektion inom samma analys

Nackdelar

• Det kan behövas flera prober för samma sekvens
• Hög kostnad

Question 13

Vilka fördelar och nackdelar finns med SYBR-baserad qPCR? Nämn 3 av varje

Answer 13

Fördelar

• Billigt och enkelt
• Mycket hög affinitet för dsDNA
• Låg affinitet för ssDNA/RNA

Nackdelar

• Mindre specifik (kan ej skilja mellan produkter/artefakter)
• Behöver annan mjukvara samt inkludera smältpunktsanalys
• Extra kontroll vid låga eller höga koncentrationer av prover