Gene therapy Flashcards
Hvilke fordele er der ved at vælge virale vektorer til gen terapi fremfor ikke-virale vektorer?
De er mere effektive til at leverer det genetiske materiale til celler.
De har evnen til at vedvare ekspressionen i længere tid specielt for de virale vektorer der integrerer det genetiske materiale i cellens genom.
Hvilke fordele er der ved at vælge ikke-virale vektorer til gen terapi fremfor virale vektorer?
De er ikke immunogene/patogene
De har en højere oplagerings kapacitet.
Hvad er replication-defekte vektorer?
Er en vektorer der mangler en eller flere proteiner af det virale genom som tillader viral replikation. Disse er udskiftet af de terapeutiske gener.
Hvad er replikation-kompetente viral vektorer?
En vektor der indeholder alle nødvendige gener for viral syntese og som bliver ved med at udbrede sig der først infektionen er sket.
Hvad er ulempen ved replikation-kompetente viral vektorer sammenlignet med replication-defekte vektorer?
Længden på de terapeutiske gener er begrænset.
Nævn de forskellige måder vektorer kan leveres på til hjernen
Injektion
Infusion i cerebrospinal væsken
Vasculatur
Hvad består retroviral vektorer af genom mæssigt og hvordan fungerer de?
Består af ssRNA
De leverer RNA som bliver reverse transkriperet til dsDNA
Hvilke fordele er der ved retroviral vektorer?
Lav immunogenitet
Kan loades med 7-9 kb
Kan integrerer DNA ind i cellen og skaber derved en stabil langtids genekspression.
Brugbar ved cancer celler, da de kun kan integrere deres DNA ved mitotiske celler
Hvordan afleverer retroviral vektorer deres materiale?
Ved at fusionerer med plasmamembranen og levere indholdet direkte til cytoplasmaet.
Hvilke ulemper er der ved retrovirale vektorer?
Risiko for at inducerer mutagenese
Kan kun leverer sit materiale i mitotiske celler.
De produceres ved lave titer og kræver derfor proviral integration ind i værtscellen for ekspression.
Hvad er mutagenese?
Når et proto-onkogen aktiveres ved at der integreres DNA tæt på en promotor sekvens, som skaber tumor formation.
Hvad er simpel onkoretrobiral vektorer?
Er en simpel retrovirus med onkogen potentiale.
Hvilke fordele er der ved simpel onkoretrovirale vektorer?
Høj titer
Langtidsstabil ekspression
Stor kapacitet.
Hvilke ulemper er der med simpel onkoretroviral vektorer?
Risiko for mutagenese (især leukæmi)
Risiko for udvikling af replikation-competent retrovirus hvis den kombineres med human retrovirus.
Inficerer kun delene celler.
Hvornår er det en fordel at bruge virale vektorer der kun inficerer delene celler?
Hvis ens target er cancer.
Hvad er Lentivirale vektorer?
Virus baseret på HIV, som kan vi få påsat det fremmede virus protein (pseudotype) vesicular stomatitis virus G envelope, for at ramme flerer typer væv.
Hvilke fordele er der ved at bruge lentivirale vektorer?
De er ikke afhængige af at cellen deler sig for at inficerer den.
Er fordelagtig at bruge ved integrering i introns i transkriptionelle aktive gener = mere sikker.
Reduceret onkolytisk potentiale
Høj titer
Høj kapacitet
Langtidsstabil ekspression.
Hvilke ulemper er der ved bruge lenitvirale vektorer?
Risiko for mutagenese
Risiko for udvikling af replikation-competent retrovirus hvis den kombineres med human retrovirus.
Tilstedeværelse af tat og rev proteiner som kan give et immunrespons.
Hvad består Herpes simplex viral vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?
Er dsDNA og er en naturlig neurotrofisk virus.
Den leverer sit materiale via episomal ekspression og integrerer ikke.
Hvilke fordele er der ved at bruge Herpes simplex viral vektorer til genterapi?
Høj titer Langtids episomal ekspression God kandidat for neurologisk genterapi. Høj kapacitet (50 kb) Har en cytopatisk effekt på cancer celler.
Hvilke ulemper er der ved at bruge Herpes simplex viral vektorer til genterapi?
Inflammatorisk og toksisk reaktion i patienter.
Komlpex genom med flere virale gener.
Hvordan er herpes simplex virus opbygget?
Består af lineær DNA der omringet af et capsidlag.
Capsidlaget er omringet af et lipid bilag, som er envelopen, der forbindes til capsidlaget via tegumeret. Envelopen er dækkes af forskellige former for glykoproteiner.
Hvad består adenovirale vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?
Det er dsDNA der ikke er beskyttet af en envelope.
Transporteres ind i cellen ved endocytose og afgiver sit materiale
Hvilke fordele er der ved at bruge adenovirale vektorer i gen terapi?
Kan både tranducerer delende og ikke-delende celler.
Det er episomal ekspression, som kan holde op til et år = integreres ikke.
Høj loading kapacitet (36 kb)
Høj titer.
Hvilke ulemper er der ved at bruge adenovirale vektorer i gen terapi?
Kortvarig genekspression.
Det skal re-administreres, som kan udlede et immunrespons.
Selve kapsidet kan udløse et immunrespons.
Mange af dens komponenter kan binde til blodets komponenter, som inaktiverer vira.
Mange personer har allerede neutraliserende antistoffer mod adenovira, da den er så almindelig.
Hvad vil det sige at en vector kan levere gen materiale ved episomal ekspression?
Det vil sige at det leveres som et plasmid, der kan replikeres ekstrakromosomalt, og derfor uden at påvirke det cellulære genom
Hvad består adeno-associerede virale vektorer af genom-mæssigt og hvordan fungerer de?
Det er ssDNA uden en envelope.
Den optages ved endocytose, hvorved den kan undslippe endosomet og derved levere sit virale DNA til nucleus.
Den skal co-inficeres med at hjælper plasmid, som indeholder gener for replikation fra adenovira.
Hvilke fordele er der ved at bruge adeno-associerede virale vektorer i gen terapi?
Høj titer
Ingen patogene eller cytotoksiske effekter
Kan inficere delende og ikke-delende celler
Episomal ekspression i mere end 10 år.
Hvilke ulemper er der ved at bruge adeno-associerede virale vektorer i gen terapi?
Kapaciteten er ikke så stor.
Personer har ofte neutraliserende antistoffer.
AAV vektorer er blevet meget populære som genterapi. Deres capsid kan modificeres således at de er specifikke for specielle væv. Hvilke typer vævs-specifikke promoter er det mest almindelig?
CMV
SV40
Beskrive hvad origian of replication betyder, når der er tale om et plasmid
Er direkte opstart af plasmid replikation ved rekruittering af det bakterielle makskineri
Den er kritisk for at plasmidet har evnen til at blive amplificerede af bakterier, som er en vigtig karakteristik af hvorfor plasmid er anvendelig at bruge.
Beskriv hvad antibiotisk resistens gen betyder og hvordan bruges i plasmidet
Er et gen som indsættes i plasmidet, således at kun bakterier med dette gen vil overleve en antibiotisk behandling.
Hvad er multipel kloningssted i et plasmid?
Et kort segment af DNA, som indholder flere restriktions enzym sider, der tillader nem indsætning af DNA.
Den er ofte til stede downstream fra en promotor
Restriktionssiden i MCS er unik og er ikke til stede andre steder i plasmidet, hvilket er derfor at de kan bruges til kloning.
Hvad omtales det gen, promotor eller DNA fragment som indsættes i plasmidets MCS, og som ofte er det man ønsker at undersøge?
Insert (the insert)
Hvad gør en promotor region?
Driver transkriptionen af insertet/genet ved at rekruitterer det transkriptionelle maskineri.
Hvad er en enhancer?
Er en kort DNA fragment, der kan blive bundet af proteiner, der øger transkriptionen af et specifikt gen.
Hvad er en selekteret markør?
Den bruges til at selekterer de celler, som har optaget plasmidet. Markøren er ofte i form af antibiotisk resistenst gen men under kontrol a ikke-bakterielle promotor.
Markøren kan også være et fluorescence protein.
Non-virale vektorer kan opdeles i kemiske og mekaniske. Nævn nogle kemiske non-virale vektorer
Lipoplex Polyplex Magnestisk assisterede transfection Nøgent DNA Articial kromosom
Nævn nogle mekaniske non-viral vektorer
Mikro injektion Elektroporation Nåle Gen pistol Impalefektion Hydrostatisk tryk Vedvarende infusion Sonikation
Beskriv lipoplex strukturen og hvordan de transporteres ind i nucleus
Lipider har positiv ladet hoveder som kan binde til DNA (negative phosphat), som derved pakker dem ind i hydrofobiske haler, som kan fusionerer med cellemembranen og beskytter dem mod nucleaser
Hvad er fordelene ved at bruge lipoplex som genterapi?
Består ikke af peptider, så det inducerer ikke et immunrespons
Kan indeholder store DNA sekvenser.
Er ikke toksiske
Ingen risiko for mutagenese
Hvilke ulemper er der ved at bruge lipoplex som genterapi?
De har lav transfektions efficiency, da mange af dem bliver nedbrudt i cytoplasmaet.
100-1000 gange mere DNA er nødvendig for at få samme transfektions efficiency som vira
Behandling skal gentages da det ikke integreres ind i genomet.
Hvad er polyplexes?
Er DNA som er pakket ind ipolymeres: polyethylenimin, som er positiv lades og derfor meget kationisk, hvilket gør at den kan optages cellulært.
Hvilke fordele er der ved at bruge polyplexes som genterapi?
De kan undslippe endosomet og videregive materialet til cellen.
Har høj transfektions effektivitet.
Er mindre toksisk ved lave molekyle vægt.
Hvilke ulemper er der ved at bruge polyplexes som genterapi?
Kan være cytotoksiske
Hvordan fungerer magnetisk assisterede transfektion?
DNA er pakket med magentiske nanopartikler, som vha. megentisk kræft leverer DNAet til målcellen, hvor den kan frigive sin cargo.
Hvordan fungerer genterapi med nøgent DNA?
Man har et plasmis med et humant insert som indsættes direkte ind i celler uden et leveringssystem.
Hvilke ulemper er der ved at bruge nøgent DNA i genterapi?
Det meste bliver afstødt af cellemembranen eller nedbrydes i cytoplasmaet, så det er meget lidt der kommer ind i nuleus.
Hvordan fungerer articial kromosomer som genterpi?
Er syntetisk konstruerede kromosomer som indeholder funktionelle centromere og telomere, der kan integreres og replikeres i humane nuleus.
Hvilke type vektor er stor nok til at kunne transportere gener så store som Duchene muscular dystrophy gen?
Artificial kromosomer (2.4 mb)
Hvordan fungerer mikro injektion som gen terapi?
Er en teknik til at levere DNA ind i en levende celle, som f.eks. en oocyt eller embryo med en glas mikropipette.
Forklar kort hvad elektroporation går ud på i gen terapi
Et elektrisk felt tilføres en celle, som vil få den til at danne porer og tillader derved indgang ind i cellen.
Hvordan fungerer en egenpistol som genterapi?
Metal såsom guld eller tungsten er coated med DNA (plasmid). Som skydes ind i organismen (bruges ofte til planter) som derved kopieres med resten af organismens gener.
Hvrodan fungerer impalefektion som genterapi?
Nanomateriale, såsom nanofibre, carbon, nanotubes, coated med plasmid DNA. Disse indsættes i målorganet ved brug af en chip. Celler tæt på vil alle få leveret plasmidet på samme tid og udtrykke genet.
Forklar hvordan man kan bruge ultralyd som en genterapi
Ved at tilfører ultralyd til et specifikt sted vil cellerne blive permeabel og optage det omkringliggende DNA. DNA er ofte givet vaskulært som mikrobobler.
Forklar ordet transfektion
Er en proces for at levere nøgent of oprenset nucleidsyre med ikke-virale metode til eukaryotiske celler.
Forklar ordet transduktion
Er processen for fremmede genetisk materiale er introduceret ind i cellen via virus eller virale vektorer.
Forklar ordet transformation
Er indsættelse af nukleidsyre ind i cellen.
Er ofte brugt til at beskrive ikke-viral DNA overførelse i bakterier og planter.
Hvad betyder transient ekspression af et gen?
Genet er ikke blevet integreret i genomet og forventes at blive tabt.
Hvad er CRISPRs naturlige funktion?
Det er et system som genkender og kløver invaderende nukleidsyre.
Hvad er det vigtigste for CRISPR/Cas9 for at den kan genkende og kløve gener?
Den er afhængig af single-guide RNA (sgRNA).
Beskriv hvordan CRISPR/Cas9 udøver sin effekt når den kløver DNA
sgRNA som er bundet til en spacer, som definerer det genomiske sted, der skal modificeres. Når spaceren har bundet til det genomiske sted, ved siden af PAM, er DNAet kløvet.
Derefter er det ødelagte DNA repareret af DNA reparations mekanismen.
Efter at Cas har lavet et break i en DNA sekvens er der to typer af DNA reparations mekanismer der kan træde til. Hvad gør den homologe-direkte reparation?
Kan modificerer nukleitud sekvenser præcist.
Efter at Cas har lavet et break i en DNA sekvens er der to typer af DNA reparations mekanismer der kan træde til. Hvad gør den ikke-homologe sammensætning af ender?
Den producerer insertion eller deletion der forstyrrereller inaktiverer målgenet.
Hvordan kan man ellers bruge CRISPR/Cas9 uden bruges af deres kløvning af DNA?
Man kan katalytisk inaktiverer Cas9, med forskellige regulatoriske domæner, hvorved man skaber aktivatorer eller inhibitorer der kan aktiverer eller dæmpe ekspressionen af et målgen.
Nævn de udfordringer der er ved bruges af CRISPR/Cas9
Ikke alle muterede locus har en PAM, som er den Cas bruger til at genekende.
Kan have off target bivirkninger på genomet, leverings vesikler, immunsystemet eller DNA reparations responset.
Nævn nogle gen blokerings terapier
Antisense terapi
Ribozym terapi
RNA interference
Beskriv hvordan man kan bruge antisense terapi til GOF mutationer
Oligonucleotider er opbygget således at de er komplementære til den mRNA sekvens der produceres af GOF mutation, eller til dsDNA med mutationen i sig selv, således at RNA ikke kan blive translateret til proteiner.
Hvad er ulemperne ved antisense terapi?
Antisense nukleotider er ofte nedbrudt før de når deres mål.
Variationer i formen af mål DNA eller RNA gør det svært for antisense nukleotiden at binde til den komplementære sekvens.
Beskriv hvordan man kan bruge Ribozym terapi til GOF mutationer
Et enzymatisk RNA molekyle er designet således at det kan kløve mRNA af f.eks. en mutation så det ikke translateres til proteiner.
Forklar hvordan man kan bruge RNA interference som genterapi
Er egentlig et naturligt fænomen, hvor viral dsRNA bliver nedbrudt.
Ved artificial syntese af dsRNA, der svarer til det sygdomsfremkaldende DNA, vil enzymet Dicer nedbryde dsRNA til siRNA, disse vil forme en template der genkendes og bindes af RISC, som kløver og nedbryder den komplementære RNA streng.
Hvilke udfodringer er der ved at bruge RNA interference som genterapi?
RNA molekylerne kan risikerer at blive nedbrudt inden de når deres mål.
Definer gen terapi
Er en procedure til at behandle eller forbedre en patients tilstand ved at modificerer patientens celler genetisk.
Nævn de to typer genterapi kan blive klassificeret under
Somatisk
Germline
Hvilke udfordringer er der ved at bruge genterapi på germline?
Risiko for at embryonet dør under injektionen.
Udvikling af malformationer eller tumorer.
Etik.
På hvilke to måder kan man anvende genterapi?
In vivo
Ex vivo
Hvordan kan man bruge genterapi i behandling af cancer?
Bevarer beskyttende proteiner (tumorsuppressor gener)
Inaktiverer onkogen ekspression
Leverer gener til maligne celler, så de bliver mere følsom over for medicin.
Give cancer celler proteiner, som gør dem mere genkendelige for immunsystemet.
Leverer proteiner til raske celler så de kan modstå kemoterapi.
Hvilke store tekniske udfordringer eller kritiske trin kan genterapi kategorires i?
Effekticitet af vektor transport Vedholdenhed Aktivitet Immunrespons Regulatoriske problemer Etik Fordele for firmaer finansielt.
Hvilke udfordringer skal man være særlig opmærksom på, hvis man skal designe en vektorer som leveringsmetode af geneterapi?
Vektoren skal beskytte DNA Den skal specifik leverer det til målcellen Den skal kunne igennem plasmamembranen Skal kunne undslippe endosomer Leveringen af det genetiske materiale.
På hvilken måde kan en vektor komme ind i nukleus?
Ved celledeling
Ved porer i i nucleus membranen.
Nævn andre store udfordringer der er ved genterapi
Leveringvejen Nedbrydelse via immunsystemet Mangel på receptorer der kan lukke leveringsmetoden ind og eller er de på off target celler. Krydse blod-hjerne-barrieren Størrelse p ågener.
Hvilke udfordringer i klinikken er der ved at bruge virale vektorer?
Det er svært at behandle tidligt.
Størrelse på vektor og det gen man vil indsætte.
Outcome er ofte urealistiske.
Man har kun en chance pga. immunogenitet.
