CRISPR

Question 1

Hvad står CRISPR for?

Answer 1

Clustered 
Regularly 
Interspaced 
Short 
Palindromic 
Repeats

Question 2

Beskriv strukturen af CRISPR/Cas9

Answer 2

Cas9 proteinet er sammensat med sgRNA hvorpå der er påsat en 20 nukleotid lang spacer.

Question 3

Hvad leder DNA reperatinos mekanismen non-homologe samling af ender ofte med?

Answer 3

Insertion eller deletion mutation der ofte leder til et frameshift mutation og et for tidlig stop codon.

Question 4

Hvordan kan CRISPR/Cas9 bruges til at knockout et gen?

Answer 4

Ved at inducerer et dobbeltstrenget break, som i de fleste tilfælde vil blive reperaret af den non-homologe samling af ender mekanismen, der ofte laver en insertion eller deletion, som leder til frameshift og for tidlig stop codon, hvorved genet er fjernet.

Question 5

Hvad kaldes knockout også?

Answer 5

Loss-of-function

Question 6

Før CRISPR brugte man andre typer teknologier såsom Meganucleaser, ZFN og TALENS. Hvordan fungerer meganucleaser?

Answer 6

Programmeret DNA-bindende endonuclease der kan genkende 14-40 basepar på DNA og kløve det.

Question 7

Før CRISPR brugte man andre typer teknologier såsom Meganucleaser, ZFN og TALENS. Hvordan fungerer ZFN (zinc finger nuclease)?

Answer 7

Et par designet Zinc finger proteiner, som er fusioneret til en endonuclease der kan genkende tripletter af 18-36 basepar og kløve dem.

Question 8

Før CRISPR brugte man andre typer teknologier såsom Meganucleaser, ZFN og TALENS. Hvordan fungerer TALENS (transcription activator-like effector nucleases)?

Answer 8

Et par af 12-31 TALE proteiner fusioneres til en nuclease (Fokl) der kan genekende nukleotider og kløve dem.

Question 9

Hvilke fordele er der ved CRISPR sammenlignet med de tidligere teknologier?

Answer 9

Hurtig, nem og effektiv
Billigere, da man ikke behøver at designe nye DNA bindende proteiner.
Den er modificerbar og nem at påsætte nye sekvenser.
Der kan påsættes flere guides i en konstruktion

Question 10

Hvilke ulemper er der ved CRISPR sammenlignet med de tidligere teknologier?

Answer 10

Større off-target effekt
Cas9 proteinet er stort og kan ikke pakkes i en enkelt AAV
PAM er nødvendig (eller andre lignende)
For knockout kræves der et frameshift.

Question 11

Der findes 3 strategier for at afleverer CRISPR/Cas9. Nævn de tre strategier

Answer 11

Som plasmid
Hvor mRNA for Cas9 proteinet sgRNA leveres hver for sig for senere at fusionerer.
Afleverer hele konstruktionen

Question 12

Hvilken fordel er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem et plasmid?

Answer 12

Simpelt
God stabilitet
Billig og kan gøres i en stor skala.

Question 13

Hvilken ulemper er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem et plasmid?

Answer 13

Skal translokeres ind i nukleus
Der er flere off-target effekter
Der er risiko for at det integreres ind i genomet

Question 14

Hvilken fordel er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem mRNA og sgRNA?

Answer 14

De skal kun transporteres ind til cytoplasmaet
Lavere off-target effekt
Lov toksicitet

Question 15

Hvilken ulemper er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem mRNA og sgRNA?

Answer 15

Ringe mRNA stabilitet

Question 16

Hvilken fordel er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem Cas9/sgRNA komplekset?

Answer 16

Hurtig virkning
Høj redigerings effektivitet
Lav immunogenitet
Laveste off-target effekter

Question 17

Hvilken ulemper er der ved at indsætte CRISPR/Cas9 gennem Cas9/sgRNA komplekset?

Answer 17

Det er med højere omkostning

Question 18

Hvilke virale vektorer bruges ofte til levering af CRISPR?

Answer 18

Lentivirale eller AAV vektorer.

Question 19

Hvilke andre områder ud over gene editing kan CRISPR bruges?

Answer 19

Gen regulering 
Epigenom editing 
Kromatin visualisering 
Base editing 
RNA targeting 
Kromatin topologi 
Kromatin visualisering

Question 20

Hvor kan CRISPR bruges til gene regulering?

Answer 20

Ved aktivering af gener eller ved inhibering af gen transkription, gennem katalytisk døde Cas9.

Question 21

Hvad går prime editing ud på?

Answer 21

Er indsættelse af et gen uden at lave dobbeltstrenget break.
Et katalytisk hæmmet Cas9 nickase har et påsat pegRNA med det gen man ønsker at indsætte, som vil blive reverse transkriberet.

Question 22

Hvordan fungerer base editing?

Answer 22

Er udskiftning af en basepar til et andet uden dobbeltstrenget break.
Et katalytisk hæmmet Cas9 protein har påsat en cytidin deaminase, som kløver cytidin væk. Mismatch reperation vil korrigerer ændringen.

Question 23

Ud over gen redigering og gen terapi, hvad kan CRISPR så ellers bruges til?

Answer 23

Dyremodeller 
Materialer 
Mad 
Brændstof 
Lægemiddel udvikling

Question 24

Hvilke vigtige overvejelser skal man gøre sig ved design af sin guideRNA?

Answer 24

Udvælge gen og genetiske elementer der skal manipuleres.

Skal det aktiveres, hæmmes, knockout eller ændres

Question 25

Hvilke overvejelser er vigtige hvis ens gen skal knockoutes?

Answer 25

At den kan knockoutes, hvis det essentielt kan det ikke.

Skal gøres ved den første 5´ udtrykt exon

Question 26

PAM sekvensen er nødvendig for at Cas9 kan binde, så derfor bør ens målgen ligge upstream af PAM. Hvad gør man hvis ens region ikke har en PAM tæt på?

Answer 26

Bruge Cas9 fra en anden art

Question 27

Hvilke værktøjer er der for design af sin CRISPR?

Answer 27

CRISPOR
CHOPCHOP
IDT

Question 28

Når man knockouter er den typiske reperation af breaket gennem NHEJ men den er ikke sikker hver gang. Dette resulterer i forskellige ændringer af cellernes genom. Derfor er det vigtigt at validerer sit knockout. Forklar processen for dette

Answer 28

Cellerne som har fået CRISPR/Cas9 bliver ekspanderet. Herefter kan man, hvis plasmidet også fået indsat et antiobiotika resistent gen blive selekteret gennem en antibiotika behandling, ellers kan man bruge FACS.
Når man har isoleret sine celler klones de og ekspanderes.
Herefter sender man dem til sekventering og kigger på deres genom og knockout.

Question 29

Hvilket output får man efter sekventering af sine knockout celler?

Answer 29

Hvor mange der har lavet insertion og deletion.

Question 30

Hvad er gRNA libaries og hvad er de brugelige i?

Answer 30

Er gRNA der kan ramme alle gener på genomet.
Det giver en effektiv undersøgelse af en ønsket fænotype.
Er brugbar ved fænotyper hvor man ikke kender den underligende molekylære ændring.
Målceller behandles derfor med gRNA libaries, som skaber en masse muteret celler og derved fænotyper man kan se om passer med ens egen.

Question 31

Hvordan kan man bruge CRISPR i cancer behandling?

Answer 31

Man kan inducerer ekspressionen af en tumor-specific receptor på T-celler.
CAR T-celle terapi