Gen-ekspression og teknikker (F13+F14) Flashcards
Hvad er gen-ekspression? hvorfor?
- Alle celler indeholder hele genomet
- hvilke gener, der udstrykkes, reguleres af transkriptionsfaktorer
- fra genotype til fænotype
Hvad er transkriptionsfaktorer?
kontrollorer genudtrykket ved at være aktivator eller repressor
Hvad er specielt ved prokayoter?
- ingen cellekerne
- ingen introns
- ingen histoner og nukleosomer
- cirkulært DNA
- transkription-translation kobling
Hvordan udtrykkes gener i mRNA i prokaryoter?
- flere gener er lokaliseret i operons med 1 fælles promoter
- alle gener udtrykkes i et stort polycistronisk mRNA
Hvordan reguleres gen-ekspression i prokaryoter?
- negativ kontrol = repressor
- positiv kontrol = aktivator
Hvilke mekanismer er der i negativ kontrol?
Inducer
- repressor er bundet
- fjerner den = gen aktiv
Co-repressor
- repressor er ikke bundet
- sætter den på = gen inaktiv
Hvilke mekanismer er der i positiv kontrol?
inducer
- aktivator er ikke bundet
- sætter den på = gen aktivt
inhibitor
- aktivator er bundet
- fjerner den = gen inaktivt
Hvad er en sigmafaktor?
- vejviser, som også binder RNA polymerasen
- koordinerer flere operons
De vigtigeste niveauer af regulering af eukaryoter?
- Selve DNA kromatin-modellering, DNA-methylering og andre typer
- Transkription faktorer og mediator kontrol
- Translation kontrol
- mRNA levetid
Hvad er kromatin modellering?
modellering i eu- og heterokromatin.
HAT’s –> mere eu
- acetylerer histonhaler
- mindre positiv ladning
- løs pakning til negativ DNA
HDAC –> mere hetero
- deacetylere histonhaler
- mere positiv ladning
- tæt pakning til negativ DNA
Hvad er DNA-methylering?
DNA methyltransferaser
- methylerer cystesin-rester
- sker ved CG’ør
- inaktivere gener
Hvilke andre måder kan DNA reguleres? (hvilke gen regulationer)
- rekombination = sammensætning af gen-regioner
- Gen-translokation = stykke flyttes mellem 2 kromosomer
- Gen-amplifikation = udvide gen med et stykke
- Gen deletion = mangler et stykke
Hvordan reguleres transkriptionen?
- basale regulering (er nødvendig)
- specifik regulering
Hvad er de basal regulering? hvor?
basal transkriptionskompleks
- RNA polymerase II
- generelle transkriptionsfaktorer (TF2)
hvor
- binder til TBP
- –> sidder på TATA-box
- –> sidder i core promotor region
Hvad er specifik regulering? hvor?
specifikke transkriptionsfaktorer for genet
- aktivatorer (øger)
- repressorer (hæmmer)
hvor
- sidder opstrømsk i promoter
- enhancer- og silencerregioner
Hvad er mediatoren?
- Sidder mellem basale og specifikke TF’er = loop dannes
- er Co-aktivator og/eller co-repressor
Hvordan kan transkriptionsfaktorene reguleres?
- Hormoner og andre væsktfaktorer binder til receptorer
- fosforylerings respons
- regulation af TF
Hvad er en transkriptionel kaskade?
- TF er aktivator for et produkt
- dette produkt fungerer som ny aktivator for et andet gen
- fortsætter sådan = amplificeret signal, som giver kaskade
Hvordan kan pre-mRNA reguleres post-transkription?
- alternativ splicing
- RNA editing (ændring af base efter transkription)
Hvordan reguleres translationen?
- Initieringskomplekset kan reguleres med initieringsfaktorer
- kontrol med miRNA og RNA interferens
Eksempel på regulering af initieringsfaktor
i røde blodlegemer uden kerne:
hæm-reguleret inhibitor-kinase
- hæmmer fosforylering af eIF2
–> mere aktiv
–> mere translation
Hvad er kontrol med miRNA? dannelse og funktion
dannelse
- miRNA koder ikke (eks. intron)
- kompleks med dicer
- guide strand fra miRNA binder til RISC
funktion
- finder target mRNA vha. RISC
- inducerer nedbrydning
- blokerer translation
Hvad er RNA interferens?
kan slå et gen ned i kort eller lang periode
- miRNA fra genom (kan ramme flere)
- siRNA kommer udefra (er mere speficik)
Hvordan reguleres mRNA levetid?
- Poly(A)-hale: kort hale, fordi meget er nedbrudt = gammelt mRNA
- specifikke proteiner kan binde og beskytte
Hvad er restriktionsenzymer? egenskaber
endonukleaser, som
- er sekvensspecifikke (palindrome)
- kan skærer forskudt = sticky ends
- kan skærer lige = blunt ends
Hvad kan restriktionsenzymer bruges til?
at lave rekombinant DNA fra 2 forskellige organismer
- samme enzym skærer stykker (sticky ends) fra hvert DNA
- DNA ligase sætter dem sammen
Hvad betyder det at lave amplifikation af DNA sekvensen?
klone/ lave identiske kopier af DNA sekvensen
Hvilke teknikker anvendes til aplifikation af DNA sekvens?
- DNA kloning
- PCR
Hvad er DNA kloning?
- restriktionsenzym danner rekombinant plasmid med gen vi vil have med.
- sendes ind i bakteriecelle = mange kopier
- men bliver resistent for noget antibiotika (så det fjernes)
Hvad er PCR
Polymerase chain reaction
- denatunering
- annealing
- elongering
Hvad er denatunering i PCR?
adskille DNA strengene ved opvarmning til 90-95 grader
Hvad er annealing af PCR?
- sænke temperatur til 50-60 grader
- overflod af primere sætter sig på DNA som den nye strengs 5’-ende
Hvad ellongering af PCR?
- hæve temperatur igen til 65-72 grader
- taq-polymerase (DNA) som er varmestabil begynder syntesen mod genets 3’ ende
Kan man lave PCR analyse af RNA?
ja, men det skal først laves om til DNA ved reverse transkriptase = cDNA
Hvordan kan man identificere DNA-sekvenser?
med prober
- lille stykke DNA
- mærket eller farvet
- hybridisere og binder specifikt til det vi vil se.
Hvad er DNA micro-arrays?
glasplade hvor der kan identificeres DNAs tilstedeværelse i celler
- probe viser specifikt DNA i bestemt farve
- man kan sammeligne f.eks. normale celler og kræft celler ved at give flere DNA sekvenser forskellige farve prober
Hvad er in situ hybridisering?
kan lokalisere specifikt DNA og RNA i biologiske strukturer (direkte hvor de er)
Hvad er gel elektroferase?
seperation af DNA i stykker
- tilsætter DNA i brønd
- strøm til så det vil vandre mod positiv pol
- gelen er et net = små stykker når længst
- probe mærker DNA = bånd kommer frem
Hvad er gelen lavet af? funktion?
- Agarose gel = adskille store stykker DNA, eks. PCR fragmenter
- Polyacrylamid = adskille enkelte nukleotider
Hvad er DNA sekventering? teknik til at gøre det?
- kortglægge rækkefølgen af baser
teknikker
- sanger-sekventering
- next generation sequencing
Hvad skal bruges til Sanger sekventering?
- RNA polymerase + NTP = primer
- DNA polymerase + dNTP = syntetisere sekvens
- andre enzymer til DNA syntese (ligase og RNAase H)
- ddNTP for at stoppe syntesen
Hvad er ddNTP? funktion?
- nukleotid, hvor både C2 og C3 kun er bundet til et H
- terminere syntese
Hvordan kan ddNTP bruges til at sekventere?
- Hver ddNTP er jo en af baserne = syntesen stopper ved netop den base
- ved at bruge gelelektroferase
- 1 type ddNTP puttes i hver brønd = giver bånd ud fra hvor netop den type base er i længden.
- længst fra brønd = kortest = tættest på primer (5’-ende)
Hvorfor er det smart at bruge PCR?
- hurtig og sensitiv
- kan analysere mange prøve ad gangen
- kræver meget lille startmateriale
Hvad er polymorfismer?
hyppige DNA-sekvens-variationer i en population
(ofte ikke sygdom)
Hvad er genterapi?
gen editing med CRIPSR/CAS9
- primitiv immunsystem
- CAS9 protein og sgRNA (single guide) genkender sekvenser
- klipper hele DNA over og laver reperation
Hvilke typer gen editing er der? (reperation)
- homolog: gen korrigeres med donor nukleotid
- non-homolog: gen knock-out uden nukleotid (aflæsning fuckes up)
Hvordan kan man undersøge proteiner?
- proteomics / 2D gelelektroforase = seperation efter størrelse med flourescent
- mass spectrometry
Hvad er mass spectrometry?
protein fra gel eller biopsi
- adskilles i peptider
- peptidsekvens og masse undersøges i mass spectrometer = bestemme protein
Hvad er NGS?
Next generation sequencing
- DNA fragmenter får adaptor så de binder til flowchart
- DNA bøjer + primere aplificere DNA fragment + dissociation = stor cluster.
- aplifikation sker med dNTP’er, hvor hver base er flourescent til at vise forskellige farver
- sekventering. Rækkefølge synliggøres med flourescenterne 1 ad gangen.
