Fundamentos de técnicas Flashcards
¿Qué destaca en la PCR?
Sensibilidad, reproducibilidad, eficiencia y facilidad de análisis.
¿En qué se basa la PCR?
Amplificación in vitro de ADN mediante la enzima polimerasa.
¿Qué se necesita para la PCR?
- ADN
- Taq polimerasa
- nucleótidos
- Mg2+
- primers
- buffer
¿Cuáles son las etapas de la PCR?
Desnaturalización, hibridación y extensión.
¿Qué equipos se usan en la PCR?
Termocicladores para mantener condiciones constantes.
¿Cuál es la enzima común en la PCR?
La enzima más usada en la PCR es la Taq polimerasa, proveniente de la bacteria “thermus aquaticus”. Es termoestable y puede funcionar a altas temperaturas.
¿Cuál es el papel de los primers en la PCR?
Los primers son secuencias de oligonucleótidos que delimitan la región que se amplificará. Dos secuencias de primers, forward y reverse, son esenciales para la amplificación.
¿Qué sucede en la desnaturalización de la PCR?
las cadenas de ADN se calientan a unos 95°C para separarlas y permitir la hibridación con los primers.
¿Qué ocurre en la hibridación de la PCR?
Los primers se alinean con las secuencias complementarias del ADN templado durante la hibridación, que ocurre a temperaturas entre 50-60°C.
¿Qué pasa durante la extensión en la PCR?
La Taq polimerasa sintetiza cadenas complementarias de ADN a una temperatura óptima de alrededor de 72°C, extendiendo los primers.
¿Cómo se analizan los resultados de la PCR?
Los productos de la PCR, llamados amplicones, se analizan mediante electroforesis en geles de agarosa para confirmar la amplificación de la secuencia de interés.
¿Cómo se utiliza la electroforesis en la PCR?
La electroforesis separa moléculas en geles de agarosa según tamaño y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, al ser negativos, migran hacia el lado positivo en el campo eléctrico.
¿Cómo se analizan los ácidos nucleicos en la PCR?
La electroforesis y otras técnicas permiten examinar productos amplificados para corroborar el éxito de la reacción y obtener información sobre las secuencias específicas.
¿Objetivo de la PCR en tiempo real?
Detectar y cuantificar ácidos nucleicos con fluorescencia en cada ciclo, sin necesidad de electroforesis.
¿Usos clave de la PCR en tiempo real?
Altamente sensible para detectar y cuantificar ácidos nucleicos, especialmente útil en la cuantificación de cambios en la expresión génica.
¿Ingredientes esenciales de la PCR en tiempo real?
Similares a la PCR convencional;
- enzima
- DNTPs
- Mg+
- buffer
- sistema de fluorescencia se compran por separado.
- Primers diseñados para alta especificidad y amplicones específicos (100-150 pb).
¿Función de los termocicladores en tiempo real?
- Excitan y capturan señales de fluorescencia para análisis cuantitativos.
- Diferencias incluyen fuentes de energía, velocidades de cambio de temperatura y capacidad para múltiples muestras.
¿Cómo se analizan los resultados de la PCR en tiempo real?
- Los termocicladores cuentan con software que genera gráficas de amplificación y disociación.
- La cuantificación puede ser absoluta (número exacto de copias amplificadas) o relativa (evaluación de cambios de expresión génica basada en niveles de ARNm del gen blanco comparados con un gen de referencia estable).
¿En qué se diferencia la PCR en tiempo real de la PCR en punto final?
La PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación durante cada ciclo, eliminando la necesidad de electroforesis y brindando una monitorización continua del progreso de la reacción.
