Flüssig Chromatographie Flashcards
Wie funktioniert die Säulen-Flüssigchromatographie?
Flüssige mobile Phase (Eluens, Fließmittel) wird über eine Säule (od.
Kapillare) bewegt, in der sich die stationäre Phase befindet.
Was ist Eluationstechnik?
Elutionstechnik: die in der mobilen Phase gelöste Probe wird am
Säulenanfang aufgegeben, um im Eluensstrom an der stationären Phase
vorbei nach einer für jede Substanz charakteristischen Verweilzeit in der
Säule an deren Ende eluiert zu werden.
Was ist Flash-Chromatographie und wie funktioniert sie?
• 1978, W. Clark Still et al., Columbia University, New York:
- Schnelle Trennung von organischen Komponenten aus organischen
Synthesen im Adsorptionsmodus
• Verwendung von Glassäulen
• Druck von 1,5 - 2,0 bar
Auftrennung von Substanzmengen von 0,01 - 25 g in 5 - 10 min
• Erweiterung auf Umkehrphasen-Modus
geht schneller
Auf welchem Trennprinzip beruht die Verteilungschromatographie, welche Vorteile hat sie und wo wird sie angewandt?
• Trennprinzip beruht auf Verteilungssatz von Nernst: Verteilung der
Substanzen zwischen einer flüssigen stationären und einer mobilen
Phase, die nicht miteinander mischbar sind
- stationäre Phase: meist Flüssigkeit, die durch Aufsaugen auf ein poröses
festes Trägermaterial (meist Kieselgel) gebracht wird
- flüssige mobile Phase (Elutionsmittel): darf mit der stationären Flüssigkeit
nicht mischbar sein und diese nicht lösen;
• Vorteile:
- Variationsbreite in der Wahl der beiden Phasen
- irreversible Adsorptionen sind ausgeschlossen, da ohne feste stationäre
Phase
• Anwendung: Gegenstromchromatographie (multiplikative oder CraigVerteilung)
Wofür steht DCCC?
Tröpfchen-Gegenstromchromatographie: engl. droplet countercurrent chromatography
Wofür steht HSCCC?
engl. high-speed countercurrent chromatography
Wie funktioniert die Ionenaustauschchromatographie?
• Trennung von Molekülen nach ihrer elektrischen Ladung • Stationäre Phase wird mit geladenen Gruppen modifiziert - Anionenaustauscher: positiv geladene Gruppen binden negativ geladene Moleküle, neutrale und kationische Moleküle werden direkt eluiert Bsp. Diethylaminoethyl- (DEAE) Oder: - Kationenaustauscher: negativ geladene Gruppen binden positiv geladene Ionen Bsp. Carboxymethyl- (CM) • Elution der gewünschten Fraktion durch Verdrängung mit z.B. Kochsalzlösung • Chromatographieverhalten stark abhängig vom pH-Wert der verwendeten Lösungen
Wie funktioniert die Affinitätschromatographie?
• Nutzt die spezifischen Bindungseigenschaften von Molekülen • Der zum zu reinigenden Analyt passende Ligand wird an die stationäre Phase gebunden • Bindung von Analyt und Ligand muss reversibel sein Freisetzung des Analyts möglich durch Änderung der experimentellen Bedingungen
Was beschreibt Affinität?
Der Begriff Affinität beschreibt die meist sehr
spezifische Wechselwirkung von biologischen
Makromolekülen mit bestimmten Liganden, z.B.
vom aktivem Zentrum eines Enzyms mit
Substraten oder von Rezeptoren mit
Transmittern.
Wie funktioniert die Metallchromatographie?
Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC)
• Proteinmotive mit mehreren His- oder Cys-Resten in geeigneter
Anordnung binden an Säulen, die kovalent gebundene Metallchelate
tragen.
• His-Tags (tag engl. Etikett) werden als zusätzliche Codons in die DNASequenz des zu isolierenden Proteins am C- oder N-Terminus um die
Codons eingeführt
• Durch Zusatz von Imidazol kann Protein von der Säule eluiert werden
Welche Trennsysteme gibt es bei der Ausschlusschromatographie und wie funktioniert das Trennprinzip?
• engl. Size exclusion chromatography (SEC)
• Wässrige Trennsysteme: Gelfiltrationschromatographie (GFC)
- Quervernetztes, gelartiges Dextran und wässrige Puffer
• Nichtwässrige Trennsysteme: Gelpermeationschromatographie (GPC)
- Polystyrolmatrix, organische Lösungsmittel
• Trennprinzip: Fraktionierung nach Molekülgröße (~ Molekülmasse
- Kleine Moleküle können in die Gelkügelchen (Durchmesser 10-250 µm)
eindringen, große Moleküle nicht.
- Große Moleküle (Proteine) eluieren schneller als kleine.
Wie lässt sich die Ausschlusschromatographie steuern? Welche weiteren Parameter sind von Bedeutung?
Was gilt für injizierte Moleküle und adsorptive Wechselwirkungen? Wo wird sie angewandt?
• Steuerung des Trennprozesses über Auswahl des Säulenmaterial
Unterschiedliche Porengrößen bzw. Ausschlussgrenzen
• Weitere Parameter:
- Lösungsmittel/Puffer
- pH-Wert
- Probenvolumen/Säulendimension
• Alle injizierten Moleküle werden eluiert.
- Ende der Totzeit = Ende des Chromatogramms
• Adsorptive Wechselwirkungen werden ausgeschlossen.
- Kaum Überladungseffekte
• Anwendung:
- Trennung von Oligomeren bzw. Polymeren (z.B. Proteine)
- Molekulargewichtsbestimmung
Was ist die HPLC?
• High Pressure Liquid Chromatography • Stationäre Phase fest, mobile Phase flüssig • Hohe Trennleistung durch:
- sehr kleine, druckstabile Teilchen (< 10 µm)
- Pumpen für hohe Drücke (bis 400 bar)
Welche Eigenschaften bestimmen stark die Funktion der Säule bei der HPLC?
• Eigenschaften, die die Funktion der Säulen stark bestimmen:
- Art der chemischen Modifizierung
- Teilchengrößen
- Qualität der Säulenpackung
- Porenstruktur
- Druckstabilität der Packung
- Säulenmaße (Länge, Durchmesser)
Was gilt bei der Normalphasen-HPLC für stationäre Phase, Eluent und Trennmechanismus?
Stationäre Phase: polar
• Eluent: unpolar
• Trennmechanimus: Adsorption
