F5 - Strukturbestemmelse og -analyse Flashcards
Ved hvilken bølgelængde absorbere aromatiske aminosyre?
~280 nm (pH 6)
Lambert-Beers lov
A = log(I_0/I) = epsilon x c x l
Bølgelængden på synligt lys
400 - 700 nm
Bølgelængden på röngtenstråler
0,07 - 0,15 nm (0,7 - 1,5 Å)
Ved hvilken type frekvens foregår NMR spektroskopi?
Ved radiobølge frekvens (
En peptidbindings stærkeste absorbans
190 nm (svagere absorption v. 210-220 nm
Ved hvilken bølgelængde absorbere Phe præcist ved?
257 nm
Ved hvilken bølgelængde absorbere Tyr præcist ved?
274 nm
Ved hvilken bølgelængde absorbere Trp præcist ved?
296 nm
Er det bedst at bestemme koncentrationen af et protein ved høj koncentration eller lav?
Bedst at bestemme i det lineære område, (lav-mellem), da der vil ske en skærmning ved højere koncentrationer (molekyler blokere for hinanden).
Jo længere bølgelængde, jo …. energi?
…, jo lavere energi.
Jo kortere bølgelængde, jo …. energi?
…, jo højere energi.
Hvilke aminosyre arbejder man oftest med (fluroforer) i proteiner?
Oftest Tyr og Trp
Flurocerer en peptidbinding?
Nej, en peptidbinding flurocerer ikke.
Hvilken aminosyre vil FRET være domineret af?
Trp-profil
Hvad er en fluorofor?
Fluorofor er et stof som udviser luminiscens i form af fluorescens dvs. afgiver synligt lys ved påvirkning med elektroner, ultraviolet lys eller kortbølget synligt lys.
Hvilket carbon-atom er chiralt i en aminosyre?
C_alpha atomet
Hvad er enheden for NMR signaler?
ppm (parts per million)
Hvad vil det sige at tilordne efter man har fået NMR spektrum ud?
At man tilordner signalerne fra protonerne (H) til diverse aminosyre f.eks. H_alpha i Ser12.
Hvilket spin har højest energi i NMR? Parallelt eller anti-parallelt?
Anti-parallelt har den højeste energi og vil henfalde til parallelt efter et stykke tid.
Hvad afspejler det kemiske skift?
Det kemiske miljø omkring kernen i protonen (H).
Måler man på absorption eller emission i NMR?
Man måler på den energi en kerne absorbere fra radiobølgerne, når kernens kernespin går fra parallelt til anti-parallelt.
To dimensionelt NMR-spektrum bruges til?
Måling af afstands afhængigheden af kerne spin ift. nærliggende atomer i rummet (NOE, Nuclear Overhauser Effect).
Hvilken information giver NOE signaler?
Information om afstanden imellem individuelle atomer i et protein.
HVad er afstandsbegrænsningen på et cross peak i et NOE?
Enhver cross peak svarer til er par af hydrogenatomer hvis afstand er mindre en 5 Å.
Beskriv processen fra protein til struktur i X-ray crystallografi.
1) Først crystalliseres et protein (svært)
2) Herefter sendes der x-ray igennem proteinet som skaber et diffractionsmønster.
3) Data processeres i en computer, for at få et ‘Electron density map’
4) Dette bruges til at modullere proteinet
5) Forfining af struktur –> færdig struktur
Hvad betyder krystallisation?
Danne repetitive krystaller af molekylet (ofte svært især proteiner med hydrofobe dele).
Hvad er diffraktionsprincippet?
Röngtenstråler generer et diffraktionsmønster - mønsteret repræsenterer elektrontætheden.
Hvad bidrager hvert atom til i et diffraktionsmønster?
Hvert atom bidrager til hver eneste spot i mønsteret.
Hvilken process bruger man for at komme fra diffraktionsmønster til elektrontætheds kort?
FT, Fourier Transformation
Planck ligning (energien for en photon)
E = h𝜈 = hc/𝜆 𝜈: Frekvensen for lyset /s, h: Planck’s constant (J · s) 𝜆: Bølgelængden (i meter)
Hvad er en kromofor?
Kromofor, en gruppe af molekyler, der absorberer lys i det synlige område.
Lys-sentitivt molekyle.
I hvilken tilstand er et molekyler der har optaget en photon?
I en exciteret tilstand (højere energistadie).
Hvad er fluorescence?
Emission af lys forsaget af exciteret molekyler. (altså laver energi, end den absorberet energi).
Hvad er kemisk skift mål for?
Hvor godt afskærmet en kerne er med elektroner. Jo højere afskærmning jo højere ppm.
Hvad er tilordning i NMR?
At tilordne en proton beliggenhed i molekylet ud fra et NMR signal.
Hvad er restraints i løsning af struktur via NMR?
Afstands- og vinklebegræsninger (hovedparten af de anvendte restrains er dem man kalder NOE’er).
Hvor stammer signalerne i NOE-type NMR spektre fra?
Dipol-dipol vekselvirkninger (aftager med 1/r^6)
Hvad må de opfyldte NOE’er afvige med (afstand)?
0,3 Å
Er en NMR struktur en fast struktur eller flere strukturer?
Det er et sæt af strukturer der opfylder de betingelser man har sat op f.eks. afstand og vinkelbegrænsninger (NOE’er)
Hvad står ‘rmsd’ for?
Root mean sqaure deviation
Er en høj eller lav rmsd bedst?
Jo bedre værdi (jo lavere) jo mere ligner de stukturer, man har beregnet hinanden og jo bedre er man istand til udfra sine data at reproducere strukturerne.
Hvad er en god rmsd-værdi?
Omkring 0,5 Å for C,N,C(alfa) i proteinets backbone.
Hvad kan man bruge ramachandran plot til i NMR?
Jo flere rester der er i de tilladte områder, jo bedre. (akkurathed)
Når antallet af restrains stiger, …. antallet af muligstrukutrer
falder antallet af mulige strukturer.
Hvad er faseproblemet?
Faseproblemet: Vi kender intensiteten af bølgen, men vi kender ikke fasen af bølgen.
Hvad er forfining i x-ray crystallografi?
Justering/optimering så det passer på den eksperimentelle og teoretiske model.
Hvad fortæller R-faktoren om (x-ray)?
R-faktor er et mål for hvor godt eksperimentelle struktur passer på den teoretiske struktur. God R-faktor = 0,2, Tilfældig = 0,6
(akkurathed)
Hvad fortæller B-faktoren om (x-ray)?
B-faktor er en termisk faktor. Hvor stor er sandsynligheden for at dit atom befinder sig på en given position.
Optimal B-faktor > 30Å
Hvad er fordele og ulemper ved NMR?
Fordele: Kan fortælle om dynamik i et protein. Udføres i solvent (ikke behov for krystallisering som kan ændre strukturen) Kan se hydrogen Få arbejdsprocesser. Kan undersøge ligandbindinger.
Ulemper:
Tidskrævende efterbehandling
Kun “små” proteiner (
Hvad er fordele og ulemper ved Röngten krystallografi?
Fordele: Hurtigt (kan være) Præcis Også store proteiner Metode været i brug længe
Ulemper:
Krystallisering
At lave nok materiale til krystallisering (mg)
Mange arbejdsprocesser.
Hvor er NMR og X-ray i en arbejdsprocesses?
X-ray er endpoint, hvor NMR kan være første step hvorfra man kan begynde at analysere proteinet.
Hvilken resolution har de fleste krystalstrukturer?
1,8 - 3,5 Å
Hvad er akkurathed?
Hvor tæt på det eksperimentelle data er på det “sande”/teoretiske data.
Altså hvor tæt dartpilene er på Bulls Eye
Hvad er præcission?
Beskriver hvor reproduktiv dine resultater er/hvor meget de varierer fra hinanden.
(Hvor gode er vi til at reproducere de eksperimeltielle data)
Om man kan ramme med mange dartpile samme sted.
Siger lav NOEs noget om akkurathed eller præcission?
Akkurathed, hvor mange af ens resultater der overtræder det teoretisk mulige.
Siger rmsd noget om akkurathed eller præcission?
Præcission
Hvad fortæller ekstinktionskoefficenten noget om?
Sammenhængen mellem absorbans og koncentration af protein (proportionalitetskonstant).
Kan bestemmes eksperimentielt ved at bruge kendte koncentrationer og måle absorbans. Dette plottes lineært hvorledes det efterfølgende kan bestemmes som hældningen.
Beskriv princippet i fluoroscensspektroskopi
Et molekylet absorbere en energi og går derved fra grundtilstanden til den exciteret tilstand. Når molekylet henfaldet emitterer det en foton med en energi (som er fluorescens).
Hvorfor er emmissions bølgelængden større end excitations bølgelængden?
Fordi der er energi tab (vibrationsenergi) mellem de forskellige energitilstande i forskellige vibrationstilstande mellem grundtilstand og exciteret tilstand.
Hvad er blåskifte?
Emission ved længere bølgelængde (=lavere energi) grundet fluoreforen interagerer med et POLÆRT miljø og taber energi.
Hvad er rødskifte?
Emission ved længere bølgelængde relativt til upolært solvent (=lavere energi) grundet fluoreforen interagerer med et POLÆRT miljø og taber energi ift. i upolær solvent.
Hvad er quenching?
Quenching: Alle processer der sænker emission.
Hvad er quantum yield?
Quantum yield: Antallet af fotoner der emitteres ift. Dem der absorberes
(fotoner emitteret)/(fotoner absorberet)
altså hvor meget af det absorberede lys der er emitteret.
Hvilke parameter vil anvendes til at analysere den færdige NMR struktur?
rmsd
NOE’er overtrædelser
Distance restrains
Psi og Phi vilnkler i Ramachandran plot
Kan man måle koncentrationen af et protein selvom det ikke indeholder Trp, Tyr eller Phe?
Ja, for peptidbindinger har en stærk absorption mellem 180 og 240 nm. (dog kan ekstensionskoefficient være svær at estimere)
Interagerer et en dipol i en exciteret tilstand bedst med en polær eller upolær solvent?
Interagerer bedst med en polær solvent og vil derfor tabe energi (spektrum vil være forskubbet mod højere bølgelængde, ‘Rødskift’, relativt til en dipol i upolær solvent).
Hvad er foldede proteins fluoroscencsmaksimum typisk? (Trp)
335 nm
Hvad er ufoldede proteins fluoroscencsmaksimum typisk? (Trp)
356 nm
Er foldelde eller ufoldelde proteiner den laveste fluorescensmaksimum/højeste energi (bølgelængde)?
Foldende 335 nm ift. 356 nm for ufoldede.
Ændres fluorescensen for proteinet ved ligand bindingen eller interaktion med et andet protein?
Ja, det ændre signifikant og fluorescens kan derfor bruges til at bestemme bindingskonstanter og kinetik processer.
Hvad står FRET for?
Fluorescens resonans energi transport (Overførsel)
Hvad er bruger man FRET til?
At bestemme om to fluoreforer er i nærheden af hinanden.
Hvad er princippet i FRET?
En del af første flurorefor (donor) emissions spektrum overlapper absorptions spektret af den anden fluorefor (acceptor), som vil emittere lys ved højere bølgelængde.
Hvad er intervallet som afstanden mellem donor og acceptor i FRET må være?
15 - 35 Å.
Nævn UV CD spektre minima, skæring med 0 og maksimum for alfa-helix
Minima = 222 og 208 nm
Skæring af 0 (Zero-crossing) = 200 nm
Maksimum = 192 nm
Nævn UV CD spektre minima, skæring med 0 og maksimum for beta-streng
Minima = 218 nm
Skæring af 0 (Zero-crossing) = >205 nm
Maksimum = 195 nm
Nævn UV CD spektre negativt og positivt bånd for random coil
Positivt (svagt) = 218 nm
Negativt = 195
Hvad er stokes shift?
Energiforskellen mellem den laveste energi absorbtionstop og den højeste energi emissionstop.
Giver ANS blå eller rødskifte?
Blåskifte (hydrofob miljø) = Kortere bølgelængde
