F17 - Rekombinanta proteiner Flashcards
Vid heterolog expression kan man inte vara säker på att genens promotor eller ribosombindande sekvens fungerar optimalt i värdeorganismen. Vad kan man göra åt detta?
Man brukar se till att det finns en lämplig promotor och ribosombindande sekvens redan i vektorn.
Sedan kommer kodande sekvens för en “tag” som kommer N-terminalt.
Därefter finns ett mutlipe cloning säte (MCS) som är en kort sekvens med många restriktionssäten där vi kan klistra in vår egen kodade sekvens.
Sedan kommer ytterligare kodande sekvens för en “tag” som kommer sitta i den C-terminala ändan av proteinet med stop koden.
Sist har vi en transkriptions terminator.
För expression av en gen som klonats tillsammans med en T7-promotor behövs ett särskilt RNA-polymeras som går under namnet T7-polymeras. Hur används det?
Man använder en speciell bakteriestam där genen för T7 RNA-polymeras placeras på kromosomen tillsammans med en lac-promotor. På kromosomen finns även genen för lac-repressorn som normalt blockerar transkription från lac-promotorn.
För att starta expressionen sätter man till induktorn IPTG som binder och inaktiverar lac-repressorn, vilket startar expressionen av T7-polymeras som i sin tur kommer starta transkriptionen av den klonade genen.
Nämn de olika problem och fallgropar.
För eukarytoa gener måste man utgå från cDNA vid expression i prokaryota expressionvärdar, eller använda sig av en eukaryot expressionsvärd.
Det kan bildas sekundär strukturer i mRNA:t som blockerar ribosombindningssätet som i sin tur blockerar protein syntesen.
Den klonade sekvensen fungerar som transkriptions terminator vilket gör att mRNA syntesen avslutas i förtid.
Kodon användningen i ursprungsorganismen och expressionsvärden är olika.
Det vanlugaste expressionsproblemet är att målproteinet hamnar i olöslig form s.k. inklusionskroppar. Vad beror detta på??
Detta beror på att nysyntetiserat protein aggregerar och faller ut istället för att vika ihop sig och stannar i lösning.
