DNA-sekvensering

Question 1

Vad är DNA-sekvensering?

Answer 1

metod/teknik för att fastställa ordningen på de fyra nukleotiderna

Question 2

Vad finns det för olika storlekar av DNA-avvikelser?

Answer 2

SNP
Indel: 2-1000 bp
Strukturella varianter: 1kb-3mb, ej konservativa områden
Kromosomavvikelser: >1000 mbp

Question 3

Hur fungerar Sangersekvensering?

Answer 3

PCR-metod
olika rör tillsatta med olika stoppnukleotider vilka saknar OH-grupp och är kopplad till olika fluoroforer beroende på vilken bas det är
Ju mer negativt laddad- desto större sekvens
kan mätas mha gelelektrofores eller kapillärelektrofores

Question 4

Vad finns det för fördelar och nackdelar med Sangersekvensering?

Answer 4

Fördelar:
Golden standard, väldigt exakt
väldigt bra på att hitta små genetiska avvikelser
bättre än andra metoder på att sekvensera GC-rika områden
Nackdelar:
max 500 bp kan sekvenseras-avvikelser större än 200 bp kan ej detekteras
specifika primers till varje frågeställning
risk för allelic dropout=SNP vid bindingsite

Question 5

Vad ska en tänka på vid primerdesign?

Answer 5

längd på 18-24 bp
GC-innehåll mellan 45-55%
smälttemperatur mellan 50-65 grader
GC-lock: sista 2 baserna är G/C ->starkare bindning
minst 50 bp uppströms från önskad gen

Question 6

Vad kan det finnas för anledningar bakom att ingen sekvens detekterats vid sangers?

Answer 6

primerarna har dålig design eller att bindingsite inte finns
degradering pga nedfrysning och tining
låg koncentration DNA
kontamination med EDTA, salt, fenol, etanol

Question 7

felsökning vid låga peaks med sanger?

Answer 7

dålig primerdesign
låg koncentration primers
låg koncentration DNA
kontamination av EDTA, salt, fenol, etanol

Question 8

felsökning vid ful start och svag sekvens med sanger?

Answer 8

primers som bundit till varandra

kontamination av andra primers

Question 9

felsökning vid multipla peaks i sanger?

Answer 9

flera primersites i templatet
kontamination med andra primers
kontamination av DNA med annat templat

Question 10

felsökning med fula reads som slutar plötsligt vid sanger?

Answer 10

för mycket templat

Question 11

felsökning vid artefakter i sanger?

Answer 11

för mycket färg som klumpar

luftbubblor i kapilläret

Question 12

Hur fungerar pyrosekvensering?

Answer 12

Utnyttjar bildningen av PPi varje gång nukleotid inkorporeras
Sulfyras konverterar PPi till ATP som konverteras till ljus av luciferas
kvarvarande nukleotider bryts ner av apyras

Question 13

Vad är NGS?

Answer 13

=next generation sequencing

sekvenserar flera DNA-molekyler samtidigt

Question 14

Beskriv flödesschemat för NGS

Answer 14

provbearbetning
DNA-extraktion
kvalitetscheck
bibliotekspreparation
sekvensering
bioinformatik
tolkning
rapport

Question 15

Hur sker bibliotekspreparationen?

Answer 15

Önskat DNA fångas upp och amplifieras
DNA-fragmentering
Adapterligering- prob binds till DNA som möjliggör vidfästning på ytor
Indexering- prob som används för att se skillnad på olika prover
Sekvensering

Question 16

vad finns det för olika sekvenseringstyper vid NGS?

Answer 16

Illumina sekvensering: bridge PCR, färgkonjugerade baser
Ion torrent: emulsions PCR, H+ frisätts vid varje reaktion->pH förändring
MGI: DNA-nanoboll->kluster av DNA

Question 17

Vad händer vid bioinformatiksdelen?

Answer 17

demultiplexning: delar upp olika patienter
adaptertrimning: prober tas bort
mappning: jämförelse med referensgenom
variantfiltrering: falskt positiva, ta bort känt beningna
virtuell panel, familjeutredning?
tolkning

Question 18

Hur fungerar mikroarray?

Answer 18

isolerat DNA konjugerat med fluoroserande prob tillsätts till chip där det finns brunnar med syntetiskt DNA som representerar olika delar från genomet
kan mäta hur mycket DNA som binder in
-> detektion av duplikationer, deletioner etc.

Question 19

Vad finns det för negativa aspekter med NGS?

Answer 19

NGS ger korta reads som byggs ihop till ett genom mha överlappande sekvenser eller jämförs med referens
kort läslängd dåligt om sekvenserna kan passa in på flera ställen
svårt att se strukturella varianter

Question 20

Vilka områden är svåra att sekvensera?

Answer 20

GC-rika områden
tandem repeats
pseudogener
fragmenteringsbias

Question 21

vad är MLPA?

Answer 21

används för att detektera mindre kopietalsförändringar såsom deletioner/duplikationer
2 prober som ligger precis varandra i sekvensen-> PCR-produkt endast om båda proberna ligerat med templatet
färgkonjugerade- detekteras med kapillärelektrofores

Question 22

Vad testas med transkriptom/RNAseq vid NGS?

Answer 22

RNA omvandlas till cDNA mha reverse-transkriptase
används för att se mRNA dvs genuttryck, fusioner, varianter
RNA-uttrycket varierar med vävnad och över tid