DNA recombinante Flashcards
cuáles son las 6 etapas para realizar un DNA recombinante
- localizar gen
- aislar gen con enzimas que cortan
- insertar gen en otro segmento
- introducir DNA recombinado en célula huésped
- confirmar que célula huésped tiene propiedades del DNA recombindado
- clonar gen (células se multiplican
qué es el plásmido
DNA que le da características a una bacteria, mas no es escencial
qué es un DNA recombinante
una secuencia de DNA derivada de más de una fuente
cuáles son las enzimas de restricción utilizadas para el DNA recombinante
Pst 1
EcoR 1
Hind III
las bacterias usan las endonucleasas de restricción como un
mecanismo de defensa frente a la entrada de ADN foráneo
qué hacen las enzimas de restricción en las bacterias
- degradan DNA extraño (el propio no)
cuando el bacteriófago (DNA) entra a una bacteria, esta se
contagia del virus, se rompe y contagia a más bacterias
las enzimas de restricción corta DNA del bacteriófago y lo
guardan como memoria para atacar a la próxima
a qué corresponde la primera, segunda y tercera palabra de la nomenclatura de enzimas de restricción
- género de bacteria
2 y 3. nombre de especie
en la nomenclatura de enzimas de restricción se agregan letras o números de acuerdo a la
cepa o serotipo
en la nomenclatura de enzimas de restricción se agregan números romanos de acuerdo a la
cronología en que se aislaron
qué hacen las endonucleasas
degradan DNA extraño, reconocen una secuencia y cortan ADN
qué hacen las enzimas del sistema de modificación
metilan residuos de adenina o citosina para que el ADN se vuelva inmune y no sea degradado
endonucleasa de restricción I
sitio de corte es 1000 pares de bases río abajo o arriba de la base buscada
endonucleasa de restricción II
secuencias palindrómicas
sitio de reconocimiento es igua al sitio de corte
endonucleasa de restricción III
corte lejos de la secuencia de reconocimiento (20-30 pb)
corte asimétrico
río arriba o abajo
endonucleasa de restricción IV
reconoce DNA metilado
secuencias que se leen de ambos lados
palindrómicas
características de cortes cohesivos
cortes en diferente posición
3 a 5 nt de diferencia
pares de bases libres
características de cortes romos
cortes simétricos de ambas cadenas
no hay pares de bases libres
el DNA recombinante se trata con una enzima de restricción que genera cortes
cohesivos
los fragmentos generados por la misma enzima de restricción son
complementarios
los fragmentos de DNA recombinante se unen por
ligasas
molécula dsDNA con capacidad de albergar un fragmento de DNA exógeno
VECTOR
en qué consiste la clonación de un vector
en que se replica la bacteria con el nuevo código genético (ADN)
en que consiste la expresión del vector
en producir un transcrito o proteína de los plásmidos o bacteriófagos
la clonación cuenta con (3)
origen de replicación
sitio múltiple de clonación (secuencias palindrómicas para enzimas de restricción)
marcadores de seleción
la expresión cuenta con (6)
origen de replicación
sitio múltiple de clonación
marcador de selección
promotor
IRES (unión ribosomas)
secuencia de poliA
el plásmido cuenta con
origen de replicación
gen de resistencia antibiótica
región de DNA exógeno
dsDNA
circular
separado del DNA cromosómico
está en bacterias/levaduras
plásmido
virus que infecta bacterias
bacteriófago
vectores híbridos
cósmidos
los cósmidos cuentan con (2)
plásmidos
bacteriófagos
qué es un fagémido
plásmido al que se le incorpora el origen de replicación de un fago
no tiene sitios cos
ejemplos de cromosomas artificiales
BAC (bacterias)
YAC (levaduras)
- preparación del inserto que se va a clonar
se utilizan enzimas de restricción
- preparación del vector
enzimas de restricción
desfosforilación del vector
purificación plásmido
- ligación del inserto y el vector
ligasa
- preparación de células competentes
permeabilidad de membrana para aceptar vector
glicerol 10%
CaCl2
- transformación celular
adquisición de gen exógeno
nuevo genotipo de célula
- identificación de las colonias celulares con el vector recombinante
(todos estos son los pasos de clonación)
:)
